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常用抗抑郁药，如三环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制药、                           98％）、庚二酸对照品（批号：FIMO1-QDIT，纯度：＞
        5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂、特异性的 5-HT 和去甲                     98％）、酪胺对照品（批号：LDVVF-AP，纯度：＞98％）、
        肾上腺素再摄取抑制剂（NERI）等，都围绕增加5-HT、去                       色氨酸对照品（批号：6XHKM-ON，纯度：99％）均购自
        甲肾上腺素（NE）等发挥抗抑郁作用。然而，现有的抗                           中国TCI试剂公司；脯氨酸对照品（批号：A02130623，纯
        抑郁药的治疗率低、起效时间长、复发率高等诸多不足                            度：99％）、酪氨酸对照品（批号：A02131107，纯度：
        引起了研究人员对抑郁症和抗抑郁药的重视。随着代                             98.5％）、缬氨酸对照品（批号：A02131208，纯度：99％）
        谢组学在抑郁症研究中的广泛应用，抗抑郁药的外周干                            均购自思域化工科技有限公司；谷氨酰胺对照品（阿拉
        预机制逐步凸显。以γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，                丁试剂公司，批号：J1318016，纯度：99％）；可的松（内
        GABA）为代表的氨基酸类物质与抑郁症关系的动物实                           标，中国食品药品检定研究院，批号：101128-201001，纯
        验研究显示，抑郁模型小鼠体内GABA增加是通过谷氨                           度：97.2％）；甲醇、乙腈（美国 Tedia 公司，色谱纯）；水为
        酸脱羧酶65和谷氨酸脱羧酶67两个合成限速酶的增加                           超纯水，其他试剂均为分析纯。
        引起的，从而进一步引起小鼠行为和情感状态的改变 。                           1.3 尿液样本
                                                      [3]
        随着研究的进一步深入，许多研究者又提出抑郁症与人                                本研究选取抑郁症患者和健康受试者各 6 例，分别
        体尿液中多种内源性物质相关，包括兴奋性氨基酸物质                            采集其晨尿。所有抑郁症患者均符合以下条件：（1）符
        （例如谷氨酰胺），单胺类物质代谢产物（例如 5-羟基吲                         合《中国精神障碍分类与诊断标准》第3版（CCMD-3）中
                                                                                [13]
        哚乙酸、色氨酸），NE和5-HT再摄取抑制剂（例如酪胺、                        关于抑郁症的诊断标准 ；（2）汉密尔顿抑郁量表HDRS
        酪氨酸）和其他氨基酸（例如脯氨酸、缬氨酸、庚二酸、马                          评分为17～≤28分；（3）年龄18～60岁；（4）排除脑器质
             [4-5]
        尿酸） 。建立测定尿液中上述内源性物质含量的方法，                           性疾病、严重躯体疾病、药物滥用和药物过敏者，以及青
        对研究上述物质与抑郁症的关系具有重要意义。                               光眼、内分泌疾病及严重自杀企图者；（5）既往无药物服
            朱晓伟、马晓丽等        [6-7] 利用柱前或者柱后衍生法建              用史。所有健康受试者（18～60 岁）和抑郁症患者的心
        立了测定氨基酸的含量测定方法；Filee R、Thianthum S                  电图、胸片检查、血生化、血常规、尿常规及免疫学检查
        等  [8-9] 将柱后茚三酮衍生联用离子交换色谱法（Ion-ex-                  结果均正常。本研究方案已经通过武汉市第三医院伦
        change chromatography，IEC）广泛地运用于氨基酸的含               理委员会的论证，受试者均签署书面知情同意书。
        量测定。虽然上述方法具有良好的分离度、线性范围和                            2 方法与结果
        重现性，但是，其分析时间较长，尤其对于尿液样本，方                           2.1  色谱条件与质谱条件
        法的专属性可能会因为与其余化合物潜在的相互作用                                 色谱柱：XTerra RP18 （100 mm×3.91 mm，3.5 µm）；流
        而降低。此外，反相高效液相色谱（RP-HPLC）柱后邻                         动相A：0.1％乙酸-水，流动相B：0.1％乙酸-乙腈，梯度条
        苯二甲醛衍生化用于测定氨基酸含量时虽然也分析时                             件 ：0～1 min 99％ A，1～9 min 99％ →68％ A，9～11
        间较短及灵敏度较高，但是其样品前处理方法较为复                             min，68％→1％A，11～14 min 1％A；流速：0.45 mL/min；
        杂 [10-12] 。                                         进样量：5 μL；柱温：40 ℃；进样器温度：4 ℃。
            本研究选择将尿液样品经乙腈处理后，采用液相色                              采 用 电 喷 雾 离 子 源（ESI），以 多 反 应 监 测 方 式
        谱-质谱串联（LC-MS/MS）法测定其中5-羟基吲哚乙酸、                     （MRM）正离子模式进行定量分析，源喷射电压：5.5 kV，
        谷氨酰胺、马尿酸、庚二酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、酪                          雾化温度：500 ℃，雾化气（N2 ）压力：20 psi，辅助气（N2 ）
                                                            压力：10 psi，气帘气（N2 ）压力：20 psi。9 种待测物和内
        胺、缬氨酸的浓度。由于生物内源性的空白样本较难获
                                                            标的质谱参数见表1，二级质谱图见图1。
        取，本研究在方法学考察过程中，全部将健康人体尿液
                                                                     表1 9种待测物和内标的质谱参数
        样本中氨基酸类内源性物质的本底扣除。经方法学考
                                                            Tab 1 MS parameters of 9 determinand and internal
        察，该方法专属、准确、灵敏度高，可用于临床健康人体
                                                                   standard
        和抑郁症患者尿液中上述9种内源性物质的含量测定。
        1 材料                                                序号  待测物          离子对      去簇电  入口电   碰撞能， 碰撞室出口
                                                                                      压，V   压，V   eV   电压，V
        1.1 仪器                                              1   5-羟基吲哚乙酸   m/z 192.2→146.1  66  8  17   7
            1200 高效液相色谱仪，包括 G1322A 在线脱气机、                   2   谷氨酰胺       m/z 147.2→130.0  34  8  24   13
                                                            3   马尿酸        m/z 180.1→105.1  34  8  16   4
        G1312B 泵、G1316B 柱温箱、G1367C 自动进样器（美国
                                                            4   庚二酸        m/z 161.1→125.2  30  8  15   21
        Agilent公司）；API 5500四级杆串联质谱仪，配备电喷雾                   5   脯氨酸        m/z 116.1→70.2  37  8  20    11
        离子化源（ESI）（美国AB公司）。                                  6   酪氨酸        m/z 205.2→188.2  30  8  12   15
                                                            7   色氨酸        m/z 138.2→121.1  30  8  14   12
        1.2  药品与试剂
                                                            8   酪胺         m/z 182.0→123.0  30  10  22  17
            5-羟基吲哚乙酸对照品（批号：TGECA-MI，纯度：＞                    9   缬氨酸        m/z 118.2→72.1  40  8  13    13
        98％）、马 尿 酸 对 照 品（批 号 ：L4UOB-EC，纯 度 ：＞               10  可的松        m/z 361.2→163.0  70  9  33   8


         ·92  ·  China Pharmacy 2020 Vol. 31 No. 1                                   中国药房    2020年第31卷第1期
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