Page 95 - 2019年11月第30卷第21期

验共取50只符合要求的模型大鼠。 闭30 min后，分别放入到JNK、Akt、IRS-1、p-JNK、p-Akt、
2.3 动物分组与给药 p-IRS-1 的一抗稀释液（1 ∶ 500）中，4 ℃孵育过夜。 次
将造模成功的50只大鼠，按血糖值和体质量随机分 日，TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。二抗稀释液（1 ∶ 500）室
为5组，滋膵饮高、中、低剂量（14.0、7.0、3.5 g/kg，根据临 温孵育 2 h 后，TBST 清洗 3 次，每次 5 min。将 NC 膜放
床用量的 4、2、1 倍换算而得）组、二甲双胍（阳性对照， 置于化学发光样板上，均匀覆盖 500 μL 发光试剂，放于
0.2 g/kg 根据临床用量换算而得）组和模型组，每组 10 凝胶成像仪中避光反应 3 min，开始曝光成像。用凝胶
只。模型组和正常组大鼠给予等体积蒸馏水，灌胃体积 成像系统进行灰度分析，β-actin蛋白为内参蛋白。蛋白
均为20 mL/kg，每天给药1次，连续灌胃给药2周。 磷酸化程度以磷酸化蛋白条带灰度值与非磷酸化蛋白
2.4 各组大鼠体质量的测定 条带灰度值的比值表示 [20-21] 。
用电子秤测定各组大鼠在给药前和给药 1 周、2 周 2.9 统计学方法
后体质量变化情况。 采用SPSS 16.0进行数据处理，数据均以x±s表示，
2.5 各组大鼠血糖的测定 采用单因素方差分析进行多组间比较；采用 LSD-t 检验
末次给药后，各组大鼠禁食不禁水过夜（约8 h），尾 进行组间两两比较；以P＜0.05表示差异有统计学意义。
尖取血，并用血糖仪测定各组大鼠空腹血糖值。 3 结果
2.6 各组大鼠血清胰岛素含量的测定
3.1 各组大鼠体质量的测定结果
给药结束后大鼠禁食 8 h，腹腔注射 10％水合氯醛
给药前，与正常组比较，模型组和各给药组大鼠的
4 mL/kg麻醉，腹主动脉取血，分别于肝素钠抗凝管中收 体质量均显著降低（P＜0.01）；给药后，与模型组比较，
集，在 4 ℃下 2 500 r/min 离心 15 min，取上层血清入 1.5 滋膵饮高剂量组大鼠体质量增加，但差异无统计学意义
mL离心管中，－80 ℃冰箱保存，待用。将冻存的血清解
（P＞0.05）。各组大鼠体质量的测定结果见表2。
冻后，用酶联免疫吸附（ELISA）法检测各组大鼠血清胰
表2 各组大鼠体质量的测定结果（x±±s，n＝10）
岛素含量。
2.7 各组大鼠胰腺组织中 JNK、Akt、IRS-1 mRNA 的 Tab 2 Determination of body weight in rats of each
测定 group（x±±s，n＝10）
体质量，g
每组取 6 只大鼠的胰腺组织，质量均为 100 mg，分 组别 剂量，g/kg
给药前 给药1周后 给药2周后
别放入玻璃匀浆器中，按照总 RNA 提取试剂盒的试验 正常组 463.70±25.87 491.93±29.18 513.76±33.62
方法，提取各组大鼠胰腺组织的总RNA。然后将提取的 模型组 409.98±31.59 # 414.35±35.10 413.85±34.43
总RNA进行反转录反应，得到其对应的cDNA，再以cD- 二甲双胍组 0.2 400.37±40.95 # 405.91±47.06 410.76±50.10
滋膵饮高剂量组 14.0 429.74±29.14 # 438.77±30.67 435.72±37.55
NA为模板，进行扩增，具体试验操作流程依据相关试剂
滋膵饮中剂量组 7.0 399.61±35.98 # 400.61±41.58 399.96±43.03
盒操作说明。PCR 反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s、 滋膵饮低剂量组 3.5 411.74±17.37 # 415.67±16.60 411.96±20.67
60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。按照2 －ΔΔc t 相对定量 注：与正常组比较，P＜0.01
#
法分析目的基因与内参基因的相对表达水平。引物序 Note：vs. normal group，P＜0.01
#
列见表1。 3.2 各组大鼠血糖的测定结果
表1 引物序列 给药前，与正常组比较，其余各组大鼠空腹血糖均
Tab 1 Primer sequence 显著升高（P＜0.01）。给药后，与模型组比较，二甲双胍
名称 序列（5′→3′） 引物长度，bp 产物长度，bp 组及滋膵饮高、中剂量组大鼠空腹血糖均显著降低（P＜
JNK 上游引物 GATTTGGAGGAGCGAACTAA 20 161 0.05或P＜0.01）。各组大鼠血糖测定结果见表3。
JNK下游引物 CTGCTGTCTGTATCCGAGGC 20
Akt上游引物 TTTATTGGCTACAAGGAACG 20 215 表3 各组大鼠血糖测定结果（x±±s，n＝10）
Akt下游引物 ACAGTCTGAATGGCGGTGGT 20 Tab 3 Determination of blood glucose in rats of each
IRS-1上游引物 ACCCAAGGGCTTAGGTCAGA 20 230 group（x±±s，n＝10）
IRS-1下游引物 CCACCACGGAGTCATCCACT 20
β-actin上游引物 GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC 25 155 组别 剂量，g/kg 空腹血糖，mmol/L
β-actin下游引物 GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT 25 给药前 给药后
正常组 5.48±0.32 5.14±0.53
2.8 Western blot 法检测各组大鼠胰腺组织中 JNK、 模型组 23.29±5.58 ## 26.25±4.33
Akt、IRS-1蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平 二甲双胍组 0.2 21.24±6.03 ## 9.33±5.19 ＊＊
每组取 3 只大鼠的胰腺组织，质量均为 150 mg，分 滋膵饮高剂量组 14.0 21.20±7.21 ## 18.97±6.30 ＊
滋膵饮中剂量组 7.0 22.14±6.32 ## 19.17±7.28 ＊
别加入1 mL裂解液，在玻璃匀浆器内充分匀浆后，冰浴
滋膵饮低剂量组 3.5 22.14±5.36 ## 24.54±4.18
下静置30 min，使其完全裂解，4 ℃ 12 000 r/min离心15
##
#
注：与正常组比较，P＜0.05，P＜0.01；与模型组比较，P＜0.05，
＊
min，提取上清液，并用 BCA 法测定蛋白浓度。SDS- ＊＊ P＜0.01
PAGE 凝胶电泳分离目的蛋白 JNK、Akt、IRS-1，将电泳 Note.vs. normal group， P＜0.05， P＜0.01；vs. model control
#
##
分离后的蛋白转移到NC膜上，用5％的封闭奶粉室温封 group，P＜0.05， P＜0.01
＊
＊＊
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