Page 90 - 2019年11月第30卷第21期

红色荧光细胞为坏死细胞，计算各组细胞坏死率。试验 μmol/L 组差异有统计学意义（P＜0.05），其 LDH 的释放
重复3次。 率接近80％，结果见表2。
2.7 Western blot 法检测细胞中 Caspase 3、Cleaved- 表1 各组细胞活力抑制率结果（x±±s，n＝6）
Caspase 3蛋白表达 Tab 1 Viability inhibition rate of cells in each group
将细胞置于 37 ℃、含 5％CO2的培养箱中培养 24 h （x±±s，n＝6）
后，用 PBS 冲洗细胞 2～3 次，转移至 1.5 mL 离心管中， 组别 浓度，μmol/L A 活力抑制率，％
加入适当体积RIPA（含蛋白酶抑制剂、磷酸化抑制剂）， 空白对照组 0.42±0.01
冰上孵育30 min，移液器反复吹打，确保细胞完全裂解， 白鲜碱组 50 0.41±0.02 3.28
100 0.31±0.01 ＊＊ 26.84
然后以 12 000 ×g 离心 5 min，收集上清，即为总蛋白溶 150 0.24±0.01 ＊＊ 43.46
液。二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量后，经十二烷基
＊＊
注：与空白对照组比较， P＜0.01
硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳分离，转入醋酸纤 Note：vs. blank control group， P＜0.01
＊＊
维素印迹膜上，5％脱脂奶粉封闭 2.5 h，Caspase 3、β-ac- 表2 各组细胞LDH释放率测定结果（x±±s，n＝6）
tin 一抗（1 ∶ 500）孵育过夜，TBST 洗膜 3 次，辣根过氧化 Tab 2 Results of LDH release rate of cells in each
物酶标记的羊抗兔IgG二抗（1 ∶ 3 000）孵育1 h，TBST洗 group（x±±s，n＝6）
膜 3 次，置于凝胶成像仪中，ECL 发光，观察反应条带， 组别 浓度，μmol/L 吸光度 LDH释放率，％
Image J 软件分析条带灰度值，以目的蛋白条带与内参 空白对照组 0.09±0.03
（β-actin）条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达 白鲜碱组 50 0.18±0.11 14.83
100 0.37±0.16 43.05
量。试验重复3次。
150 0.60±0.14 ＊ 79.37
2.8 彗星试验检测细胞DNA损伤
＊
注：与空白对照组比较，P＜0.05
将细胞置于 37 ℃、含 5％CO2的培养箱中培养 24 h Note：vs. blank control group，P＜0.05
＊
后，各组取200 μL细胞悬液，置于1.5 mL离心管中，与低 3.3 白鲜碱对脾淋巴细胞早期凋亡的影响
熔点琼脂糖凝胶以体积比为1 ∶ 1的比例混匀，铺于用高 在细胞孵育24 h后，与空白对照组比较，白鲜碱50、
熔点琼脂糖凝胶制备后的载玻片上，4 ℃固化18 min，随 100、150 μmol/L 组脾淋巴细胞的早期凋亡比例虽有升
后将载玻片置于新鲜配制的 4 ℃预冷的细胞裂解液当 高，但差异均无统计学意义（P＞0.05），结果见图2、表3。
中1.5 h，蒸馏水漂洗，置于电泳槽中，18 V、300 mA下电 10 4 10 4
泳30 min，随后蒸馏水漂洗，用0.4 mol/L的Tris-Hcl缓冲
10 3 10 3
液中和 3 次，每次 5 min，加入无水乙醇固定 1 h，室温下
过夜。阅片时，在载玻片表面滴加2 mL溴化乙锭，荧光 PI 10 2 PI 10 2
显微镜观察，CASP-1.2.3 软件进行结果分析，测定 DNA 10 1 10 1
拖尾区域比例[拖尾面积/（拖尾面积+头部面积）]，比例 10 0 10 0
10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
越大代表 DNA 损伤越严重。每组选 30 个细胞进行测 Annexin Ⅴ-FITC Annexin Ⅴ-FITC
定，试验重复3次。 A.空白对照组 B.白鲜碱50 μmol/L组
2.9 统计学方法 10 4 10 4
采用SPSS 19.0软件对结果进行统计分析。数据资 10 3 10 3
料以 x±s 表示，采用单因素方差分析，方差齐时两组间 PI 10 2 PI 10 2
比较采用 LSD-t 检验，方差不齐则采用 Kruskal-Wallis
10 1 10 1
检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
3 结果 10 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
3.1 白鲜碱对脾淋巴细胞活力的影响 Annexin Ⅴ-FITC Annexin Ⅴ-FITC
C.白鲜碱100 μmol/L组 D.白鲜碱150 μmol/L组
在细胞孵育 24 h 后，与空白对照组比较，白鲜碱
图2 各组细胞凋亡测定的流式细胞图
100、150 μmol/L 组脾淋巴细胞活力显著受到抑制（P＜
Fig 2 Flow cytograms for apoptosis of cells in each
0.01），并在设定浓度范围内呈现浓度依赖性趋势，其中
group
150 μmol/L 白鲜碱组脾淋巴细胞的活力抑制率达到
40％以上，结果详见表1。 3.4 白鲜碱对脾淋巴细胞坏死的影响
3.2 白鲜碱对脾淋巴细胞LDH释放率的影响 在细胞孵育24 h后，与空白对照组比较，白鲜碱50、
在细胞孵育24 h后，与空白对照组比较，白鲜碱50、 100、150 μmol/L组脾淋巴细胞坏死率均不同程度升高，
100、150 μmol/L 组脾淋巴细胞中 LDH 的释放量均不同 并呈剂量依赖性趋势；其中，白鲜碱 150 μmol/L 组差异
程度增加，且呈现浓度依赖性趋势。其中，白鲜碱 150 有统计学意义（P＜0.05），结果见图3、表4。

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