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鲜皮对免疫系统可能存在的损伤作用作出初步探索。                             淋巴细胞），总淋巴细胞纯度≥90％。脾淋巴细胞鉴定
        1 材料                                                的流式细胞图见图1。
        1.1 仪器                                                      10 4
            3001型酶标仪、3111型CO2培养箱（美国Thermo公
                                                                    10 3
        司）；DXFLEX型流式细胞仪（美国Beckman公司）；C300
        型凝胶成像仪（美国 Azure Biosystems 公司）；H-2050R                     CD19-PE  10 2
        型 离 心 机（湖 南 湘 仪 实 验 室 仪 器 开 发 有 限 公 司）；
        DYY-6D 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司）；                                  10 1
        TH4-200型荧光倒置显微镜（日本奥林巴斯株式会社）。
                                                                    10 0
        1.2 药品与试剂                                                      10 0   10 1  10 2   10 3  10 4
            白鲜碱标准品（北京坛墨质检科技有限公司，批号：                                               CD3-FITC
        484-29-7，纯度：≥98％）；小鼠淋巴细胞提取液（深圳达                             图1 脾淋巴细胞鉴定的流式细胞图
        科为生物技术有限公司，批号：33R021607）；RPMI-1640                  Fig 1 Flow cytogram for identification of spleen lym-
        培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青生物                              phocyte
        有限公司）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞                    2.2 小鼠原代脾淋巴细胞的分组及给药
        凋亡与坏死检测试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性                               调整脾淋巴细胞密度为每1 mL 2×10 个，铺于96孔
                                                                                               6
        检测试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司，批号：                             板中，每孔100 μL，设置4个试验组：其中，空白对照组加
        C1062M、C1056、C0016）；CD3-FITC鼠单克隆荧光抗体、               入RPMI-1640培养基100 μL（终体积为200 μL，细胞终密
        CD19-PE鼠单克隆荧光抗体（美国Biolegend公司，批号：                   度为每1 mL 1×10 个）；3个白鲜碱组均加入含药RPMI-
                                                                           6
        100204、115508）；低熔点琼脂糖凝胶、MTT试剂（北京索                   1640 培养基 100 μL（终体积为 200 μL，细胞终密度为每
        莱宝科技有限公司）；高熔点琼脂糖凝胶（法国 Biowest                       1 mL 1×10 个，DMSO终浓度为0.05％，白鲜碱终浓度分
                                                                     6
        公司）；胱天蛋白酶 3（Caspase 3）兔多克隆抗体、β-肌动                   别为50、100、150 μmol/L）。每组设6个复孔，振荡混匀。
        蛋白（β-actin）兔多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊                       2.3  MTT法测定细胞活力抑制率
        抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗（美国 Proteintech 公司，批                    将“2.2”项下各组细胞置于37 ℃、含5％CO2的培养
        号：19677-1-AP、20536-1-AP、SA00001-2）；ECL发光试剂          箱中，培养 20 h 后每孔加入 MTT 溶液 20 μL，继续培养
        盒（北京康为世纪生物科技有限公司，批号：CW0049M）。                       4 h，DMSO溶解，然后于570 nm波长下用酶标仪测定各
        1.3  动物                                             孔吸光度（A）值，计算细胞活力抑制率[细胞活力抑制率
            健康 SPF 级 ICR 小鼠，6～8 周龄，体质量（18～20）              （％）＝ （A 空白对照组－A 给药组）/A 空白对照组×100％]。试验重复
        g，购自辽宁省长生生物有限公司，实验动物生产许可证                           6次。
        号：SCXK（辽）2015-0001。动物实验部分符合齐齐哈尔                     2.4  LDH法检测脾淋巴细胞LDH释放率
        医学院实验动物伦理要求。                                            将“2.2”项下各组细胞置于37 ℃、含5％CO2的培养
        2 方法                                                箱中培养 24 h 后，在室温下以 100×g 离心 5 min，取上清
        2.1  小鼠原代脾淋巴细胞的分离及鉴定                                液，按 LDH 细胞毒性检测试剂盒说明操作并计算细胞
            断颈处死小鼠，医用酒精浸泡5 min，无菌分离小鼠                       LDH释放率，试验重复6次。
        脾组织，置于 200 目尼龙网上，加入 5 mL 小鼠淋巴细胞                     2.5  流式细胞术检测细胞早期凋亡
        提取液，缓慢研磨，将细胞悬液置于15 mL离心管中，加                             将“2.2”项下各组细胞置于37 ℃、含5％CO2的培养
        入 1 mL 的 RPMI-1640 培养基，在室温下以 800×g 离心               箱中培养 24 h 后，将细胞置于 1.5 mL 离心管中，在室温
        30 min，取中间淋巴细胞层，置于 15 mL 离心管中，加入                    下以 100×g 离心 5 min，弃上清，加入 1 mL PBS 重悬，再
        10 mL 的 RPMI-1640 培养基，颠倒洗涤，在室温下再以                   在室温下以 100×g 离心 5 min，PBS 反复洗涤 3 次，按细
        250×g离心10 min，倾倒上清液，磷酸盐缓冲液（PBS）重                    胞凋亡检测试剂盒说明书操作，经流式细胞仪检测，设
                                                                                 －
        悬细胞，此时台盼蓝拒染率≥90％，即活细胞比例≥                            定（Annexin Ⅴ-FITC）/PI 象限为早期凋亡区，计算各组
                                                                              +
        90％。调整脾淋巴细胞密度为每 1 mL 1×10 个，取 200                   细胞早期凋亡细胞的比例，记为早期凋亡率。试验重复
                                               6
        μL 细胞悬液，按 CD3-FITC 荧光抗体、CD19-PE 荧光抗                 3次。
        体说明书加入抗体，4 ℃避光静置 30 min 后，加入 600                    2.6 Hoechst 33342和PI双染法检测细胞坏死
        μL 的PBS（含1％胎牛血清），吹匀，室温下以250×g离心                         将“2.2”项下各组细胞置于37 ℃、含5％CO2的培养
        10 min，弃上清，加入 500 μL 的 PBS，吹匀，进行流式细                 箱中培养 24 h 后，将细胞置于 1.5 mL 离心管中，在室温
        胞术检测，试验重复 3 次。发现 B 淋巴细胞比率为                          下以100×g离心5 min，弃上清，加入800 μL细胞染色缓
        （75.50±1.05）％、T 淋巴细胞比率为（14.53±0.65）％                冲液，按照细胞凋亡与坏死检测试剂盒说明书操作，经
        （CD3-FITC 标记的为 T 淋巴细胞，CD19-PE 标记的为 B                荧光显微镜观察，设定弱蓝色荧光细胞为正常细胞，强


        ·2964  ·  China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 21                                中国药房    2019年第30卷第21期
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