Page 65 - 2019年11月第30卷第21期
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8.5 Hz，H-2′，H-6′），7.19（2H，d，J＝8.5 Hz，H-3′，H-5′），    2.4.1  细胞培养      分别取 HCT116、A549、HepG2 细胞
        4.81（2H，s，CH2NHCH2CH3 ），4.25（3H，s，OCH3 ），3.57       以含 10％胎牛血清的高糖 DMEM 培养基（含青霉素
        （2H，q，CH2NHCH2CH3 ），1.73（3H，t，CH2NHCH2CH3 ）；        100 u/mL，链霉素 100 μg/mL）培养于 37 ℃、5％CO2、饱
        13
         C-NMR（DMSO，600 MHz） δ ：182.6（C-4），156.3            和 湿 度 的 培 养 箱 内 ，每 隔 2～3 d，以 0.05％ 胰 蛋 白
        （C-4′），154.9（C-7），154.6（C-9），153.8（C-2），152.8       酶-0.53 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）消化传代。
        （C-5），130.9（C-6），130.3（C-2′，6′），124.6（C-1′），122.4   2.4.2  分组与给药       分别取对数生长期的 HCT116、
        （C-3），115.8（C-3′，5′），105.8（C-10），98.5（C-8），60.9     A549、HepG2细胞，用胰酶消化，吹散，制备细胞混悬液，
        （OCH3 ），44.0（CH2NHCH2CH3 ），40.0（CH2NHCH2CH3 ），      调整细胞密度，按6×10 个/孔接种到96孔板中，在37 ℃
                                                                                3
        9.65（CH2NHCH2CH3 ）；根据以上数据确定该化合物为8-                  下培养过夜。试验分为化合物1～6组（分别加入化合物
        （N-乙基）-亚甲基胺基-5，7，4′-三羟基-6-甲氧基异黄酮。                   1～6溶液至终浓度为2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L）、
        2.2.7  化合物 6     淡黄色结晶性粉末（EtOH）；熔点：                 空白对照组（只加培养基）和鸢尾黄素组（阳性对照，加
        188～190 ℃；紫外的λ max：273 nm；红外的ν max：3 375，           入鸢尾黄素溶液终浓度为 2.5、5、10、20、40、80、160
                                        － 1
        1 658，1 438，1 222，1 149，1 045 cm ；ESI-MS（m/z）：      μmol/L），每个浓度做3个重复，放入37 ℃、5％CO2培养
                   1
        372 [M+H] ；H-NMR（DMSO，600 MHz）δ：12.98（1H，s，         箱中培养48 h。
                  +
        5-OH），8.17（1H，s，H-2），7.32（2H，d，J＝8.5 Hz，H-2′，       2.4.3  检测方法     采用MTT比色法       [21-22] ，在培养时间结
        H-6′），6.74（2H，d，J＝8.5 Hz，H-3′，H-5′），3.87（2H，s，      束前4 h，将96孔板里的培养液吸出，加入100 μL磷酸盐
        CH2NHCH2CH2CH3 ），3.72（3H，s，OCH3 ），2.53（2H，t，        缓冲液和10 μL 5 mg/mL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，再加
        CH2NHCH2CH2CH3 ），1.46（2H，m，CH2NHCH2CH2CH3 ），        入 100 μL 10％十二烷基磺酸钠溶液，37 ℃孵育过夜。
        0.87（3H，t，CH2NHCH2CH2CH3 ）；C-NMR（DMSO，600           使用酶联免疫检测仪测定 570 nm 波长处的光密度
                                     13
        MHz）δ：181.4（C-4），162.2（C-4′），154.3（C-7），151.7      （OD），计算抑制率，抑制率（％）＝（空白对照组OD值－
        （C-9），151.1（C-2），150.7（C-5），133.2（C-6），130.9（C-2′，  药物组 OD 值）/空白对照组 OD 值×100％，采用 Curve
        6′），123.4（C-1′），122.6（C-3），115.8（C-3′，5′），102.3（C-  Expert 软件计算半数抑制浓度（IC50 ）。鸢尾黄素和化合
        10），99.8（C-8），60.8（OCH3 ），51.3（CH2NHCH2CH2CH3 ），    物1～6对3种癌细胞株IC50的测定结果见表2。
        44.6（CH2NHCH2CH2CH3 ），23.6（CH2NHCH2CH2CH3 ），        表2   鸢尾黄素和化合物1～6对3种癌细胞株IC50的测
        11.3（CH2NHCH2CH2CH3 ）；根据以上数据确定该化合物                       定结果（n＝3）
        为 8-（N-正丙基）-亚甲基胺基-5，7，4´-三羟基-6-甲氧基                  Tab 2  Determination results of IC50 of tectorigenin
        异黄酮。                                                       and compounds 1-6 to 3 kinds of cancer cell
        2.3  鸢尾黄素和化合物1～6的溶解度考察                                     lines（n＝3）
            按照2015年版《中国药典》一部凡例21的溶解度试                                                 IC50，μmol/L
                                                            组别
        验方法 考察鸢尾黄素和化合物 1～6 的溶解度。称取                                      HCT116细胞       A549细胞        HepG2细胞
               [1]
        研成细粉的7个化合物，置于（25±2）℃的适量水中，每                         化合物1组       34.82±3.27     37.05±5.51    23.74±1.45
                                                            化合物2组       65.24±4.42     94.32±5.41    84.21±4.24
        隔5 min强力振摇30 s，观察30 min内的溶解情况，并根
                                                            化合物3组       16.21±4.13     26.88±4.52    18.96±2.34
        据《中国药典》中对各种溶解性能的定义进行判断。鸢                            化合物4组       53.62±2.31    101.13±4.56    75.86±3.74
        尾黄素和化合物1～6的溶解度测定结果见表1。                              化合物5组       33.12±3.25     30.13±6.23    30.95±2.87
           表1 鸢尾黄素和化合物1～6的溶解度测定结果                           化合物6组       91.64±6.58    113.71±5.36    88.15±10.66
                                                            鸢尾黄素组       45.23±5.74     53.24±6.34    48.98±2.58
        Tab 1   Determination results of solubility of tectori-
                                                                由表 2 可知，鸢尾黄素衍生物化合物 1、3、5 对
                genin and compounds 1-6
                                                            HCT116、A549、HepG2细胞的IC50均低于鸢尾黄素，其中
        化合物                             溶解度，mmol/L
        化合物1                               6.2              化合物3对HCT116、HepG2细胞的IC50均＜20 μmol/L。
        化合物2                               4.6              2.5  鸢尾黄素和化合物1～6对H22肝癌荷瘤小鼠的抑
        化合物3                               2.8              制作用研究
        化合物4                               3.8              2.5.1  样品溶液的制备        将鸢尾黄素和化合物1～6，分
        化合物5                               3.6
        化合物6                               1.4              别用溶剂（70％生理盐水、25％DMSO、5％聚山梨酯 80
        鸢尾黄素                               0.3              混合溶液）溶解，配制成 10 mg/mL 混悬液，－20 ℃保存
            由表1可知，与鸢尾黄素比较，鸢尾黄素衍生物化合                         备用。
        物 1～6 的溶解度明显提高，其中化合物 1 的溶解度最                        2.5.2  分组、给药与检测        参考文献[23]的方法，取小鼠
                                                                                              7
        大，达到6.2 mmol/L，是鸢尾黄素的20倍。                           腹腔接种 7 d 的 H22 细胞，配制成 1×10 mL 单细胞混
                                                                                                  －1
                                                                                                         6
        2.4  鸢尾黄素和化合物1～6对HCT116、A549、HepG2                  悬液，在无菌条件下接种于小鼠右侧腋下，每只2×10 个
        细胞体外增殖的影响                                           细胞。接种第2天，将小鼠随机分为空白对照组、鸢尾黄

        ·2940  ·  China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 21                                中国药房    2019年第30卷第21期
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