Page 58 - 2019年11月第30卷第21期
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0.5％）中，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至所需浓                        过夜。洗膜后，将膜与 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 二抗
        度。对照组细胞中加入DMSO溶液，苯扎贝特组细胞中                          （经小鼠、人免疫球蛋白吸附）（稀释比例：1∶10 000）共同
        依次加入12.5、25、50、100、200 µmol/L的苯扎贝特溶液，              孵育1 h后，将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，
        非诺贝特组细胞中依次加入12.5、25、50、100、200 µmol/L              并使反应持续5 min，暗盒显影。通过Image J软件分析
        的非诺贝特溶液，作用 48 h 后，各孔加入 CCK8 混合液                    目标条带灰度，以GAPDH为内参，计算c-myc蛋白相对
        10 µL，37 ℃孵育3 h，在酶标仪450 nm波长处测定光密                  表达量。
        度（OD），试验重复 3 次。计算细胞存活率（％）＝（加药                      2.5 统计学方法
        组OD/对照组OD）×100％。                                       所有数据以 x±s 表示，应用 SPSS 17.0 统计软件进
        2.2 细胞周期与细胞凋亡率的检测                                  行分析，多组比较采用ANOVA方差分析，方差齐时采用
            参考文献[10]方法，采用流式细胞法检测细胞周期                       LSD检验进行两两样本之间的多重比较，方差不齐时采
        与细胞凋亡率。 取对数生长期的 PC-9 细胞，调整细胞                       用 Dunnett’s T3 检验进行多重比较。P＜0.05 表示差异
                       －1
        密度为 1×10 mL ，接种 2 mL 于 6 孔板内，置于 37 ℃、              具有统计学意义。
                   6
        5％CO2培养箱中培养 12 h。试验设对照组，苯扎贝特                       3 结果
        低、中、高浓度组和非诺贝特低、中、高浓度组，对照组细                         3.1 细胞存活率
        胞中加入DMSO溶液，苯扎贝特低、中、高浓度组细胞中                             12.5、25、50、100、200 µmol/L 的苯扎贝特作用下
        依次加入25、50、100 µmol/L的苯扎贝特溶液，非诺贝特                   PC-9 细 胞 存 活 率 分 别 为（80.76 ± 3.2）％ 、（74.35 ±
        低、中、高浓度组细胞中依次加入25、50、100 µmol/L的非                  5.06）％ 、（62.8 ± 1.23）％ 、（59.03 ± 1.55）％ 、（39.8 ±
        诺贝特溶液，作用48 h后，经0.25％胰蛋白酶消化，收集                      1.01）％；而非诺贝特作用下 PC-9 细胞存活率分别为
        细胞悬液，然后加入70％冰乙醇5 mL混匀固定，4 ℃放                       （74.46 ± 1.30）％ 、（61.91 ± 4.77）％ 、（48.95 ± 2.8）％ 、
        置24 h以上。按试剂盒操作流程，加入碘化丙啶（PI）和                       （37.05±1.55）％、（32.49±1.36）％。苯扎贝特和非诺贝
        膜联蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-异硫氰酸荧光素（FITC），分别                  特均可不同程度降低PC-9细胞的存活率，并且苯扎贝特
        检测各组细胞周期与凋亡率。                                      和非诺贝特的抑制作用呈浓度依赖性，随浓度的增加，
        2.3  细胞中c-myc mRNA表达的检测                            其抑制作用也增强。与苯扎贝特组比较，非诺贝特对
            采用 qRT-PCR 法检测细胞中 c-myc mRNA 表达水               PC-9 细胞的增殖抑制作用更强，其中浓度在 25～100
        平。试验分组与给药情况同“2.2”项下方法操作，作用                         µmol/L 内两药的抑制作用差异具有统计学意义（P＜
        48 h后，收集细胞，加入1 mL Trizol缓冲液，抽提样品中                  0.05），12.5和200 µmol/L时两药的抑制作用差异无统计
        总RNA，并对所提取的RNA进行纯度检测及总RNA完                         学意义（P＞0.05）。不同浓度苯扎贝特和非诺贝特作用
        整性检测。反应条件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃               下PC-9细胞存活率曲线见图1。
        15 s，60 ℃ 32 s，40 个循环。融解曲线分析：温度 60～                       100
        95 ℃，每个样品重复3次。以GAPDH为内参，荧光信号                               80
        由 ABI PRISM 7500 型 qRT-PCR 仪检测，最后按 2       ΔΔct 法        ％  60                             非诺贝特组
                    ®
        计算 c-myc mRNA 的相对表达量，ΔΔct＝Δct 给 药 组 －                    细胞存活率，        #                   苯扎贝特组
        Δct 对照组。引物序列与片段长度见表1。                                      40                #    #
                    表1   引物序列与片段长度                                 20
            Tab 1  Primer sequence and fragment length             0
                                                                    0    12.5  25   50   100   200
        基因         引物序列                         碱基数，bp                         浓度，μmol/L
        c-myc      上游：ACACATCAGCACAACTACGC        20           注：与苯扎贝特组比较，P＜0.05
                                                                               #
                   下游：CCTCTTGACATTCTCCTCGGT       21                             #
        GAPDH      上游：GGGAAACTGTGGCGTGAT          18           Note：vs. bezafibrate group，P＜0.05
                   下游：GAGTGGGTGTCGCTGTTGA         19       图 1   不同浓度苯扎贝特和非诺贝特作用下 PC-9 细胞
        2.4 Western blot检测c-myc蛋白表达                              存活率曲线
                                                           Fig 1 Survival rate curve of PC-9 cells treated with
            参考文献[11]方法，采用Western blot法检测细胞中
                                                                  different concentrations of bezafibrate and fe-
        c-myc 蛋白表达水平。试验分组与给药情况同“2.2”项
        下方法操作，作用48 h后，收集细胞，细胞中加入100 μL                            nofibrate
        裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟）进行细胞                           3.2 细胞周期
        裂解，提取蛋白并测定总蛋白浓度。以10％的聚丙烯酰                              与对照组比较，苯扎贝特中、高浓度组和非诺贝特
        胺凝胶电泳分离蛋白质，转PVDF膜，封闭后，加入兔抗                         中、高浓度组细胞中 G1期细胞占比明显增加，差异具有
        人c-myc单克隆抗体（稀释比例：1 ∶ 10 000），4 ℃下放置                统计学意义（P＜0.05），苯扎贝特低浓度组和非诺贝特


        中国药房    2019年第30卷第21期                                             China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 21  ·2933  ·
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