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抗菌作用的活性多肽，并根据其来源分为哺乳动物抗菌                           （上海碧云天生物技术有限公司）；兔源 His 标签多克隆
        肽、水生动物抗菌肽、两栖类抗菌肽、昆虫抗菌肽、植物                           抗体（上海博耀生物科技有限公司，批号：SZB0053）；羊
        抗菌肽和细菌抗菌肽等类别 。已有研究发现，抗菌肽                            抗兔辣根过氧化物酶（HRP）标记 IgG 二抗（北京中杉金
                                 [2]
        对部分真菌、细菌和病毒具有明显杀伤作用，能促进伤                            桥生物技术有限公司，批号：ZB-2301）；Ni-Agarose His
               [3]
        口愈合 ，其在抗菌领域的应用价值受到了学者的广泛                            标签蛋白纯化试剂盒（包涵体蛋白）（康为世纪生物技术
        关注，也成为了研究热点。                                        有 限 公 司 ，批 号 ：00091512）；异 丙 基 硫 代 半 乳 糖 苷
            我国有着丰富的药用植物资源，其中银杏（Ginkgo                      （IPTG）、PH0311 细菌细胞总蛋白提取试剂盒、LB 培养
        biloba Linn.）在我国种植历史悠久、资源丰富，其药用价                    基、胶回收试剂盒及 AEC 底物显色试剂盒、十二烷基磺
        值在古代中医典籍中也早有记载。现代研究证实，银杏                            酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂[生工生物
        叶提取物中的银杏酸、银杏酚酸等成分具有一定的抑菌                            工程（上海）股份有限公司]；其余试剂均为分析纯或实
        活性  [4-5] 。但银杏提取物的抑菌效果受原料来源、温度条                     验室常用规格，水为无菌蒸馏水。
        件、pH 值等因素影响较大，且存在抑菌成分驳杂、分离                          1.3 动物
        过程繁琐、产量低、质量难以控制等缺点 。近年来，随                               健康IR小鼠，雌雄各半，体质量20～22 g，购自重庆
                                           [6]
        着分子生物学等技术的不断发展，深入开发利用中药植                            腾鑫生物技术有限公司[动物生产合格证号：SCXK（渝）
                                [7]
        物资源成为可能，如刘缙等 从银杏种仁中分离纯化出                            2017-0007]。动物均在环境温度（20±3）℃、湿度（55±
        一种抗菌蛋白，命名为GNK2-1，并证实其对黄瓜镰刀孢                         5）％的条件下适应性喂养 7 d 后进行后续实验，期间正
        菌具有较强的抑制作用；又如荆贝贝 从银杏种仁中分                            常饮食。本实验过程符合动物福利准则。
                                        [1]
        离纯化得到抗菌肽，其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以                            1.4 菌株
        及黄瓜镰刀孢菌等 14 种真菌均有一定的抑制作用。上
                                                                感受/表达态大肠杆菌由吉尔生化（上海）有限公司
        述研究主要是从银杏种仁原料中分离得到具有抑菌活
                                                            提供；大肠杆菌（ATCC 35218）、金黄色葡萄球菌（ATCC
        性的银杏抗菌肽，但这一过程对植物原料种属及质量等
                                                            25923）、绿脓杆菌（ATCC 27853）和鼠伤寒沙门氏菌
        要求高，加之工艺步骤较繁琐、工艺条件要求较高，使得
                                                           （CMCC 50115）菌株均由贵州中医药大学形态实验室
        纯化蛋白产量较低。基于此，本研究利用现代分子生物                            提供。
        学技术深入开发银杏抗菌多肽，根据 Genebank（https：//                  2 方法
        www.ncbi.nlm.nih.gov）中公布的一种具有抑菌活性的银
        杏抗菌肽（Ginkgo biloba antimicrobial peptide，GBA）基      2.1  重组蛋白的合成与鉴定          [10-13]
        因序列（编号：FJ865399），对该抗菌肽进行重组蛋白载                           本课题组参考相关文献              ，委托吉尔生化（上海）
                                                            有限公司和生物生工（上海）股份有限公司构建重组质
        体构建，再以大肠杆菌原核表达获取重组蛋白，并考察
                                                            粒 pET32a（+）-GBA 及酶切鉴定，并进行重组质粒的转
        所得重组蛋白对临床常见致病菌的抑制活性                    [8-9] ，旨在简
                                                            化、阳性克隆筛选和重组蛋白的表达、纯化及鉴定。
        化抗菌肽的制备环节、实现抗菌肽重组蛋白的规模化生
                                                            2.1.1  重组质粒构建与酶切鉴定             根据 Genebank 中公
        产，为解决病原菌耐药问题、进一步开发利用及规模化
        生产植物源性新型抗菌剂提供实验基础。                                  布的 GBA 序列（编号：FJ865399）的 ORF（开放阅读框）
        1 材料                                                序列片段（405 bp），采用 Primer Premier 5.0 软件设计上
        1.1  仪器                                             下游含限制性内切酶BamH I和Xho I识别位点的序列，
            UV-900S型紫外-分光光度计（上海元析仪器有限公                      利用 PCR 技术扩增，经 1.5％琼脂糖凝胶电泳回收 PCR
        司）；PowerPac  TM  Basic 型多功能电泳仪、T100 Thermal         产物。采用 BamH I 和 Xho I 酶切 PCR 产物和表达载体
        Cycle 型梯度聚合酶链反应（PCR）仪（美国 Bio-Rad 公                  pET32a（+）质粒。回收酶切产物，取 5 μL 经 1％琼脂糖
        司）；TD5A-WS 型低速大容量离心机（湖南湘立科学仪                        凝胶电泳初步鉴定酶切所得基因片段大小与目标片段
        器有限公司）；CJ-1D 型洁净工作台（天津市泰斯特仪器                        一致后，回收纯化酶切产物，并通过T4 DNA连接酶将目
        有 限 公 司）；Micro 21R 型 高 速 离 心 机 、ChemiDoc      TM    的基因序列定向克隆至 pET32a（+）质粒的 BamH I 和
        XRS+型凝胶成像仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公            Xho I位点，获得重组质粒。
        司）；EL104型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限                       2.1.2  重组质粒转化及阳性克隆筛选               将“2.1.1”项下
        公司]。                                                重组质粒通过冷刺激法转化到感受态大肠杆菌 BL21
        1.2 药品与试剂                                          （DE3）菌株中；取已转化菌株，接种至含有 100 ng/mL
            重组表达质粒pET32a（+）-GBA、TB培养基[吉尔生                   Amp 的 TB 培养基（以下简称“含 Amp 培养基”）中，于
        化（上海）有限公司]；M-H培养基（杭州天和微生物试剂                         37 ℃条件下倒置培养 12～16 h。对培养所得单菌落进
        有限公司）；氨苄青霉素（Amp）、DNA Marker、考马斯亮                    行基因测序，取测序结果证实为阳性的菌株继续培养，
        蓝R250（北京索莱宝科技有限公司）；高纯质粒小量制备                         提取重组质粒，转化到表达态大肠杆菌 Rosetta gami 菌
        试 剂 盒（北 京 百 泰 克 生 物 技 术 有 限 公 司 ，批 号 ：              株中。转化后的表达菌株进行复苏培养后，取适量，接
        00091512）；PVDF 膜（美国 Millipore 公司）；蛋白 Marker         种至含 100 μg/mL Amp、15 μg/mL 卡那霉素、34 μg/mL


        ·2514  ·  China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 18                                中国药房    2019年第30卷第18期
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