Page 72 - 2019年9月第30卷第18期
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克林霉素的LB培养基中,于37 ℃倒置培养至对数生长                         和最低杀菌浓度(MBC)测定             参照文献方法       [18-20] ,采用
        期,挑取单菌落进行基因测序,检测判断是否转化成功。                          肉汤稀释法进行测定。取“2.1.4”项下所得纯化重组蛋
        2.1.3  重组蛋白的表达         挑取“2.1.2”项下经基因测序            白,在96孔板中采用M-H液体培养基倍比稀释,每孔加
        证实转化成功的菌株,接种至含Amp的LB培养基,置于                         入“2.2.1”项下 4 种菌悬液各 0.01 mL,作为给药组;同时
        100 mL 培养瓶中,于 37 ℃下以 220 r/min 摇床培养过               设置不加菌液、只加入相应不同质量浓度的重组蛋白溶
        夜。取培养完毕的菌液,按 1%的体积比接种至含 Amp                        液孔作为空白对照组。各组细胞在 37 ℃培养 18 h 后,
        的LB培养基,于37 ℃下以220 r/min摇床培养至对数生                    采用紫外分光光度计在550 nm波长处测定吸光度。以
        长期时,加入终浓度为 1 mmol/L 的诱导剂 IPTG,在                    给药组培养孔未出现混浊变化、且吸光度值与空白对照
        37 ℃下诱导蛋白表达 3 h。将表达完毕的菌液以 5 000                    比较无明显差异所对应的最高药物浓度作为该重组蛋
                                                                                [17]
        r/min 离心 5 min,收集沉淀,以磷酸盐缓冲液(pH7.4)重                白对上述各细菌的 MIC 。另吸取给药组培养液 0.01
        悬菌液,超声(功率:400 W,频率:60 kHz)处理直至细                    mL至LB培养基平板,于37 ℃下培养18 h后,以平板上
        胞破碎,再以 12 000 r/min离心30 min,取其上清和沉淀                无任何菌落生长对应的最低药物浓度作为该重组蛋白
                                                                              [18]
        分别进行SDS-PAGE分析后显示,重组蛋白主要存在于                        对上述各细菌的MBC 。每种菌株平行测定3次。
        沉淀中,表明所得目标蛋白以包涵体形式存在。                              2.2.3  重组蛋白对金黄色葡萄球菌感染模型小鼠的保
        2.1.4  重组蛋白的复性与纯化            取“2.1.3”项下包涵体         护作用考察        根据体外抑菌考察结果,以金黄色葡萄球
        沉淀,采用 PH0311 细菌细胞总蛋白提取试剂盒提取重                       菌为对象,参照文献方法          [19-20] 确定其对小鼠的100%致死
        组蛋白。将蛋白提取液置于透析袋中,并以复性液作用                           剂量(100%MLD)。取金黄色葡萄球菌,在M-H平板上
        过夜。取复性完毕后的提取液,在4 ℃下以13 000 r/min                   于37 ℃培养6 h,取菌落适量,研磨,加入生理盐水制成
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        离心 15 min,取沉淀重新溶解于含 8 mol/L 尿素的 Bin-               浓度约为10×10 、5×10 、2.5×10 个/mL的菌悬液,然后按
        ding buffer 中,再次采用复性液进行作用,重复操作 3                   每 100 mL 菌悬液加入酵母 5 mg,混匀。取健康小鼠 30
        次。取复性后的上清液,采用 Ni-Agarose His 标签蛋白                  只,随机分为3组,每组10只,分别腹腔注射上述含酵母
        纯化试剂盒过柱纯化。将纯化后的重组蛋白液冷冻干                            的不同浓度菌悬液(0.5 mL/只)。每日观察小鼠死亡情
        燥,即得。                                              况,确定金黄色葡萄球菌对小鼠的 100%MLD 约为 10×
        2.1.5  纯化重组蛋白分子量的测定              取“2.1.4”项下纯       10 个/mL 。
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        化后重组蛋白,加无菌蒸馏水制成质量浓度为0.4 g/mL                           参照文献方法       [19-21] 考察重组蛋白对金黄色葡萄球菌
        的溶液,以氢氧化钠调节pH为7.0~7.2,采用SDS-PAGE                   感染模型小鼠的保护作用。取小鼠60只,随机分为空白
                                                                                                        [21]
        进行纯度检测及回收。采用 Western blotting 法,将纯                 对照组、细菌对照组、阳性药物组(青霉素,0.98 g/kg )
        化蛋白转膜并先后加入一抗兔源His-tag抗体(1∶3 000)、                  和重组蛋白低、中、高剂量组(2.0、4.0、8.0 g/kg,参照阳性
        羊抗兔HRP标记IgG二抗(1∶3 000)进行孵育,然后采用                    药物的临床剂量换算制定,其中重组蛋白的高剂量与阳
        AEC底物显色试剂盒进行显色反应,按说明书方法计算                          性药物临床用药量较为接近),每组10只。各组小鼠实
        重组蛋白分子量。                                           验前均禁食 16 h,然后灌胃相应药液(20 mL/kg,青霉素
        2.2  重组蛋白的体内外抑菌作用考察                                或重组蛋白均以生理盐水配制),空白对照组和细菌对
        2.2.1  重组蛋白对4种常见细菌的药物敏感度考察                   参     照组小鼠灌胃等体积生理盐水,每日 1 次,连续给药 7
        考文献方法     [14-16] 并加以改良,采用纸片扩散法进行体外                d。在第7天给药30 min后,除空白对照组外,其余各组
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        药敏试验。取“2.1.4”项下所得纯化重组蛋白,以无菌蒸                       小鼠腹腔注射浓度约为10×10 个/mL(即100%MLD,以
        馏水制成质量浓度为 0.4 g/mL 的溶液,将 6 mm 圆形定                  生理盐水配制)的金黄色葡萄球菌菌液(0.5 mL/只),继
        性滤纸片在该溶液中浸泡 2 h,烘干,制成药敏纸片,备                        续给药,每日1次,连续5 d。观察并记录感染5 d内的小
        用;另同法以无菌生理盐水浸泡滤纸,制成阴性对照纸                           鼠死亡情况,以死亡率来评价对金黄色葡萄球菌感染模
        片。取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和鼠伤寒                           型小鼠的保护作用        [20-21] 。实验重复3次。
        沙门氏菌菌株,接种于无选择性的LB琼脂培养基上,于                          2.3 统计学方法
        37 ℃下孵育过夜后,挑取菌落适量,加入生理盐水,混                             采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析。计数资
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        匀,得5×10 ~5×10 CFU/mL的菌悬液。取上述菌悬液,                   料以例数或率表示,组间比较采用χ 检验;计量资料以
        分别均匀涂于M-H培养基平板,每个平板贴2片重组蛋                          x±s 表示,组间比较采用方差分析。P<0.05 为差异有
        白药敏纸片和1片阴性对照纸片,于37 ℃下培养16 h后,                      统计学意义。
        测量抑菌环直径。按抑菌圈直径判断药物敏感度:抑菌圈                          3 结果
        直径>20 mm者为极度敏感,15~20 mm者为高度敏感,                     3.1 重组质粒的鉴定结果
        10~14 mm者为中度敏感,>0~<10 mm者为低度敏感,                        对重组质粒经BamH I和Xho I进行双酶切后,其产
                        [17]
        0 mm者为无敏感性 。每种菌株平行测定3次。                            物经1%琼脂糖凝胶后显示,在250~500 bp处有明显条
        2.2.2  重组蛋白对4种常见细菌的最小抑菌浓度(MIC)                     带(见图 1 箭头处),与预期插入的目的基因片段(405


        中国药房    2019年第30卷第18期                                            China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 18  ·2515  ·
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