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3 讨论                                               的消除情况，勿需代谢物的具体信息，适用于新药研发
                                                                                     [19]
            肝脏是代谢的主要器官，是药物进行生物转化的重                         早前阶段的代谢稳定性研究 。鉴于研究成本及方法
        要场所。在这个复杂的生理过程中，药物被各种代谢酶                           的易操作性，本研究选用了底物消除法对 CAA 的酶动
        分解、转化成不同的分子（即代谢物）以发挥其药理活                           力学参数和代谢稳定性进行了初步考察。
        性。与体内代谢研究相比，体外代谢研究具有成本低                            3.4 CAA在不同种属肝微粒体中的代谢特征分析
        廉，操作方法简便、快速，结果重现性好等优点，适用于                              本研究结果显示，经孵育后，CAA 在 3 个种属肝微
        新药研发候选化合物代谢行为的早期研究及筛选                       [7-8] 。  粒体中的 t1/2由小到大依次为比格犬（68.61 min）、大鼠
        为此，本研究对 CAA 在不同种属肝微粒体中的代谢行                         （72.19 min）、人（364.75 min），CLint 由小到大依次为人
        为进行了初步探讨。                                          [0.003 8 mL/（min·mg）]、大鼠[0.019 2 mL/（min·mg）]、
        3.1 UPLC-MS/MS条件的筛选                                比格犬[0.020 2 mL/（min·mg）]，表明该化合物在比格犬
            在建立孵育体系中 CAA 质量浓度测定的 UPLC-                     和大鼠体内代谢稳定性一般，在人体内代谢稳定性良
        MS/MS法时，考虑到比格犬和人肝微粒体价格昂贵、研                         好。这提示比格犬和大鼠与人之间存在一定差异。动
        究成本较高，且不同种属经灭活的肝微粒体间的差异不                           物为药物代谢行为研究提供了生理学载体，但物种间的
        大，故本研究以大鼠肝微粒体为介质，进行方法学考察。                          差异可能会对人体内代谢情况的模拟造成影响，故在选
            在色谱流动相的筛选过程中，本研究比较了乙腈和                         择实验动物时应予以关注。
        甲醇的分离效果。结果显示，与甲醇相比，乙腈可使待                               综上所述，本研究成功建立了测定大鼠肝微粒体中
        测物具有更高的质谱响应和更低的背景噪声，色谱峰峰                           CAA 质量浓度的 UPLC-MS/MS 法，该方法简便、快速、
        形更佳，故选择乙腈作为流动相的有机相。此外笔者还                           专属性强、灵敏度高，可用于肝微粒体孵育体系中 CAA
        发现，在流动相中添加适量甲酸可提高待测物的电离强                           质量浓度的测定及体外代谢稳定性的研究。CAA 在大
        度，并可缩短CAA的保留时间，故在两相比例优化的基                          鼠、比格犬、人肝微粒体中的代谢特征有所差异，其代谢
        础上，最终将流动相确定为水（含 0.1％甲酸）-乙腈（含                       可能与Ⅰ相代谢酶有关。本课题组后续将借助高分辨
        0.1％甲酸）（45∶55，V/V）。                                质谱、波谱等手段进一步确证CAA的代谢产物，并结合
            在质谱扫描模式的考察中，本研究比较了正、负离                         体内外研究进一步阐明其代谢特征，以期为该化合物的
        子模式下待测物的质谱响应情况。结果发现，在正离子                           开发利用提供更多参考。
        模式下，CAA 基本无响应；而在负离子模式下，CAA 和                       参考文献
        内标的响应均较强。因此，本研究选择了负离子模式。                           [ 1 ]  王璐.树豆酮酸 A 调节血糖血脂的作用和机理研究[D].
            本课题组前期对槲皮素、儿茶酚、儿茶素、染料木                              广州：广州中医药大学，2012.
                                                           [ 2 ]  GANDHI GR，JOTHI G，ANTONY PJ，et al. Gallic acid
        素、葛根素、杨梅素等内标物质进行了筛选。结果发现，
                                                                attenuates high-fat diet fed-streptozotocin-induced insulin
        以染料木素为内标时，该化合物与CAA可基线分离，且
                                                                resistance via partial agonism of PPARγ in experimental
        两者回收率均较高，故以染料木素作为 CAA 定量分析
                                                                type 2 diabetic rats and enhances glucose uptake through
        的内标。                                                    translocation and activation of GLUT4 in PI3K/p-Akt sig-
        3.2  底物浓度的选择                                            naling pathway[J]. Eur J Pharmacol，2014. DOI：10.1016/
            在体外代谢研究中，受试底物的浓度不能太高，否                              j.ejphar.2014.10.044.
        则将无法保证其 20％的清除率；另一方面，受试底物的                         [ 3 ]  OHASHI M，GAMO K，TANAKA Y，et al. Structural de-
        浓度也不宜过低，否则底物可能在极短的时间内就被清                                sign and synthesis of arylalkynyl amide-type peroxisome
        除完全   [17-18] 。为此，本课题组前期对 1、5、10 μg/mL 等 3              proliferator-activated receptor γ（PPARγ）-selective antago-
        个质量浓度 CAA 的孵育情况进行了考察。结果显示，                              nists based on the helix12-folding inhibition hypothesis
        当CAA的质量浓度为5 μg/mL时，剩余药物浓度并不太                            [J]. Eur J Med Chem，2015. DOI：10.1016/j.ejmech.2014.
                                                                11.017.
        高，且大部分种属肝微粒体中有 20％的药物被清除，故
                                                           [ 4 ]  CHEN WZ，FAN LL，XIAO HT，et al. First total synthesis
        最终将孵育底物CAA的质量浓度定为5 μg/mL。
                                                                of natural products of cajanolactone A and cajanonic acid
        3.3 酶动力学参数检测方法的选择
                                                                A[J]. Chin Chem Let，2014. DOI：10.1016/j.cclet.2014.03.
            代谢稳定性研究多采用产物生产法和底物消除
                                                                027.
        法。其中，产物生产法考察的是单位时间内代谢产物的
                                                           [ 5 ]  吴桐，阳海鹰，原梅，等.雷公藤甲素在人和大鼠肝微粒体
        生成量，并将产物生产速率和反应时间进行米氏方程拟                                代谢消除和酶动力学的比较研究[J].中国药理学通报，
        合，以获得相应的酶动力学参数，适用于代谢物已知且                                2018，34（10）：1414-1419.
        代谢物标准品易获得的药物的代谢研究；而底物消除法                           [ 6 ]  鲁艳柳，刘浩，曾瑶，等.石斛碱在体外肝微粒体代谢的种
        则是以母体化合物在不同时间点的消除量来反映底物                                 属差异研究[J].天然产物研究与开发，2018，30（9）：


        中国药房    2019年第30卷第18期                                            China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 18  ·2501  ·
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