Page 56 - 2019年9月第30卷第18期

37 ℃水浴中进行孵育，分别于孵育 0、5、10、15、30、45、 进行比较，以相对误差（RE）来考察准确度。结果，CAA
60 min 时，加入含内标（2 μg/mL）的乙腈 400 μL 终止反 定量下限质量浓度以及低、中、高质量浓度QC样品的日
应，涡旋混匀 30 s，于 4 ℃下以 16 000×g 离心 10 min，取 内、日间RSD均小于10％，RE为－4.83％～8.94％，符合
上清液以氮气流吹干，残渣用甲醇 200 μL 复溶，再以 ％ 100
80
16 000×g离心10 min，取上清液适量进行UPLC-MS/MS relative abundance， 60
分析，考察各时间点待测物的含量 。各孵育体系均平 40
[12]
20
行操作3次。 0 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
t，min
2.3 UPLC-MS/MS定量分析 ％ 100
2.3.1 色谱与质谱条件 色谱柱：Waters BEH C18 （50 80
60
20
mm×2.1 mm，1.7 μm）；保护柱：Waters VanGuard BEH C18 relative abundance， 40
（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：水（含 0.1％甲酸）-乙 0 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
腈（含 0.1％甲酸）（45 ∶ 55，V/V）；流速：0.25 mL/min；柱 t，min
％ 100
温：30 ℃；进样量：2 μL；采集时间：6 min。电离源：ESI； 80
扫描模式：选择反应监测（SRM）模式；扫描方式：负离子 relative abundance， 60
40
扫描；喷雾电压：2 963.64 V；气化温度：270 ℃；气帘气压 20 0
力：25 psi；用于定量分析的离子对：m/z 353.14→309.11 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
t，min
（CAA，透 射 电 压 ：164.39 V，碰 撞 能 ：17.13 eV）、m/z A.空白孵育样品
％ 100
269.86→224.11（内标，透射电压：181.03 V，碰撞能：24 2
eV）。 relative abundance， 50 1
2.3.2 专属性 分别取空白孵育样品（不含待测物和内 0
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
标，以经高温灭活的大鼠肝微粒为介质，按“2.2”项下 t，min
方法制得）、CAA 对照样品（含待测物 5 μg/mL 和内标 ％ 100 1
2 μg/mL，以经高温灭活的大鼠肝微粒为介质，按“2.2”项 relative abundance， 50
下方法制得）、孵育 15 min 时的样品（大鼠肝微粒体，按 0
“2.2.2”项下方法处理）各适量，按“2.3.1”项下色谱与质 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
t，min
谱条件进样分析，记录色谱图。结果，内标和CAA的色 ％ 100 2
谱峰峰形良好，其保留时间分别约为 0.79、3.61 min，内 relative abundance， 50
源性物质不干扰待测物的测定，表明该方法专属性好， 0
详见图2。 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
t，min
2.3.3 标准曲线、定量下限、最低检测限的考察 取 B. CAA对照样品
“2.1.1”项下 CAA 贮备液适量，加至经高温灭活的大鼠 ％ 100 1
肝微粒体孵育体系（0.2 mL）中，制得CAA质量浓度分别 relative abundance， 50 2
为 0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、20 μg/mL 的系列标准曲线 0
对照溶液，按“2.2.2”项下方法孵育 15 min 并处理，再按 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
t，min
“2.3.1”项下色谱与质谱条件进样分析，记录峰面积。以 ％ 100 1
待测物质量浓度（c，μg/mL）为横坐标、待测物与内标峰 relative abundance， 50
面积的比值（y）为纵坐标，采用加权最小二乘法（加权系 0
数为 1/c）进行线性回归，得回归方程为 y＝12.98c+0.92 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
t，min
（R ＝0.997 3）。结果，CAA 检测质量浓度的线性范围
2
％ 100 2
为 0.05～20 μg/mL，定量下限为 0.05 μg/mL（信噪比为
10∶1），最低检测限为0.01 μg/mL（信噪比为3∶1）。 relative abundance， 50
2.3.4 准确度与精密度试验 按“2.3.3”项下方法配制 0 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
CAA 定量下限质量浓度（0.05 μg/mL）样品以及低、中、 t，min
C.肝微粒体孵育样品
高质量浓度（0.1、2.5、10 μg/mL）质控（QC）样品各 5 份， 注：1.内标；2.CAA
按“2.2.2”项下方法孵育15 min并处理，再按“2.3.1”项下 Note：1. internal standard；2. CAA
色谱与质谱条件进样分析，考察日内精密度；连续测定 图2 典型SRM图
3 d，考察日间精密度。将实测质量浓度与理论质量浓度 Fig 2 Typical SRM chromatograms

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