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（96.66 ± 5.71）％ ，respectively. The half-life period（72.19，68.61 min）of CAA in rat and Beagle dog liver microsomes were
        significantly shorter than human liver microsome （364.74 min）. The clearance rates [0.019 2，0.020 2 mL/（min·mg）] were
        significantly higher than human liver microsome [0.003 8 mL/（min·mg）]（P＜0.05）. CONCLUSIONS：Established UPLC-MS/MS
        method is simple，rapid，specific and sensitive，and can be used for the determination of CAA concentration in liver microsome
        incubation system and the study of metabolism stability in vitro. The stability of CAA metabolism in rat and Beagle dog liver
        microsomes are poorer than human liver microsome.
        KEYWORDS     Cajanonic acid A；UPLC-MS/MS；Liver microsomes；Different species； Metabolism stability in vitro


            树豆酮酸A（Cajanonic acid A，CAA；结构式见图1）              备，批号：20180521，纯度：＞98％）；染料木素对照品（内
        是从豆科植物树豆[Cajanus cajan（Linn.）Millsp.]叶中             标，批号：528C021，纯度：＞98％）、烟酰胺腺嘌呤二核苷
        分离出的一种新的菧类化合物              [1-2] 。已有体内外研究证          酸磷酸二钠（NADP-Na2，批号：718B0225）、葡萄糖-6-磷
        实，CAA 作为肥胖症特异性靶点蛋白酪氨酸磷酸酶 1B                         酸-二钠（G-6-P-Na2，批号：116B039）、葡萄糖-6-磷酸脱
        （PTP1B）抑制剂，可明显提高胰岛素抵抗脂肪细胞对葡                         氢酶（G-6-P-DH，批号：20160725）均购自北京索莱宝科
        萄糖的吸收量，并可降低先天肥胖型小鼠的体质量和空                            技有限公司；雄性 SD 大鼠肝微粒体（批号：M10017.
        腹血糖水平、提高其葡萄糖耐受量，具有开发成糖尿病                            2017002）、雄 性 比 格 犬 肝 微 粒 体（批 号 ：M10007.
        治疗药物的潜力和价值          [3-4] 。                         2017002）、人肝微粒体（男性健康蒙古利亚人种，批号：

                              OH  O                         M10001.2017003）均购自武汉普莱特生物医药技术有限
                                    OH                      公司，质量浓度均为20 g/L（以蛋白计）；甲酸、甲醇、乙腈
                                                            均为色谱纯，氯化镁、柠檬酸钠等其余试剂均为分析纯，
                          O
                                                            水为蒸馏水。
                                O
                                                            2 方法与结果
                                                            2.1  溶液的制备
                       图1    CAA的结构式
                                                            2.1.1 CAA 和内标溶液        精密称取 CAA 对照品适量，
                     Fig 1  Structure of CAA
                                                            用甲醇溶解并定容，制得质量浓度为 1 mg/L 的 CAA 贮
            细胞色素 P450 （CYP）酶是药物Ⅰ相代谢的重要酶                     备液；同法制得质量浓度为 1 mg/L 的内标贮备液；上述
        系，主要存在于肝微粒体中，在药物生物转化过程中发                            贮备液均置于 4 ℃保存，备用。临用前，将 CAA 贮备液
        挥着至关重要的作用          [5-6] 。在新药研发的早期阶段，研究             与适量甲醇、0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4；下
        者可通过表征药物在体外不同种属肝微粒体中的代谢                             同）、肝微粒体、辅酶溶液等混合，制备孵育体系；将内标
        稳定性和代谢转化行为来分析其代谢差异                   [7-8] 。鉴于此，    贮备液用甲醇稀释，制得质量浓度为 2 μg/mL 的内标
        本研究建立了测定肝微粒体中CAA质量浓度的超高效                            溶液。
        液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），计算并比较了                       2.1.2  还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）辅
        该化合物在大鼠、比格犬和人肝微粒体中的酶动力学参                            酶溶液     A 液：依次加入 NADP-Na2、G-6-P-Na2、氯化镁
        数[消除半衰期（t1/2 ）、体外清除率（CLint ）]，旨在为CAA的               200、200、133 mg，用水定容至10 mL。B液：依次加入柠
        体内代谢研究提供参考，为其后续药效学及临床研究奠                            檬酸钠、G-6-P-DH 44 mg、1 000 U，用水定容至 25 mL。
        定基础。                                                将A、B液均置于－20 ℃保存，备用。临用前，将A、B液
        1 材料                                                按体积比 5 ∶ 1 混合，制得浓度为 1 mmol/L（按反应产物
        1.1 仪器                                              NADPH计）的辅酶溶液 。
                                                                                [9]
            UltiMate 3000 型 UPLC-TSQ Endura 型三重四极杆          2.2 样品孵育与处理
        串联质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）和Xcalibur v2.2数                  2.2.1  孵育体系的建立         取大鼠、比格犬、人肝微粒体
        据处理系统（美国 Thermo Finnigan 公司）；JN300-2 型氮             各适量，用 PBS 稀释至 0.5 g/L，随后加入“2.1.1”项下
        气吹扫仪（苏州吉米诺仪器有限公司）；X1 型高速离心                          CAA 贮备液适量，使 CAA 最终质量浓度为 5 μg/mL，同
        机（香港基因有限公司）；KH-600E 型超声波清洗器（昆                       时确保孵育体系中甲醇的含量不超过1％。将上述溶液
        山禾创超声仪器有限公司）；FA805N型十万分之一电子                         置 于 37 ℃ 水 浴 中 静 置 5 min 后 ，加 入“2.1.2”项 下
        天平（上海菁海仪器有限公司）；DW-86L486型超低温保                       NADPH 辅酶溶液以启动反应。该体系总体积为 200
        存箱（青岛海尔股份有限公司）。                                     μL，其中NADPH的终浓度为1 mmol/L，有机溶剂不超过
        1.2  药品与试剂                                          5％ [10-11] 。
            CAA对照品（贵州医科大学药物化学重点实验室制                         2.2.2  样品孵育与处理          将上述孵育体系继续置于


        ·2498  ·  China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 18                                中国药房    2019年第30卷第18期
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