Page 75 - 2019年2月第30卷第4期
P. 75

液）；兔抗人多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）单克隆                        2.2 克隆形成试验检测细胞的克隆形成能力
        抗体（美国 Cell Signaling Technology 公司，批号：9）；兔             收集对数生长期的 Capan-2 细胞，以 1×10 个/孔的
                                                                                                    3
        抗人 PMAIP1（又称 Noxa）、Bax、Bcl-2、髓样细胞白血病               密度接种于6孔板中（每孔2 mL），于37 ℃、5％CO2条件
        1（Mcl-1）、Bcl-xL 单克隆抗体（美国Abcam公司，批号分                下培养 24 h 后，将细胞随机分为空白对照组和给药组
        别 为 GR1030343-9、GR3180247-17、GR251056-12、          （Ibr、Ibr-7剂量分别均为1、2、4 μmol/L，剂量设置依据参
        GR168628-1、GR26786-9）；鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）           考“2.1.1”项）。每组设置 3 个复孔。空白对照组加入
        抗体（内参，美国 Santa Cruz Biotechnology 公司，批号：           RPMI 1640培养基2 mL，各给药组分别加入含相应药物
        J0914）；其余试剂均为分析纯，水为三蒸水。                            的RPMI 1640培养基2 mL，于37 ℃、5％CO2条件下培养
        1.3 细胞                                             48 h 后，弃去培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）清
            人胰腺癌Capan-2细胞购于中国科学院上海生命科                      洗2次，弃去上清液，加入含10％FBS的RPIM 1640培养
        学研究院生物化学与细胞生物学研究所，以含10％FBS                         基 2 mL，于 37 ℃、5％CO2条件下培养 1～2 周。待克隆
        的 RPMI 1640 培养基于 37 ℃、5％CO2 培养箱中常规                 形成后，弃去培养基，用PBS清洗2次，用0.1％结晶紫染
        培养。                                                色液染色 1 h，用 PBS 洗净后，晾干，用体式显微镜观察
        2 方法                                               细胞集落形成数量并拍照。
                                                           2.3 流式细胞术检测细胞的凋亡情况
        2.1 CCK-8法检测Ibr、Ibr-7对细胞增殖活性和药物敏
                                                                                                    5
                                                               收集对数生长期的 Capan-2 细胞，以 2×10 个/孔的
        感性的影响
                                                           密度接种于6孔板中（每孔2 mL），于37 ℃、5％CO2条件
        2.1.1  细胞的增殖活性        收集对数生长期的Capan-2细
                                                           下培养 24 h 后，将细胞随机分为空白对照组和给药组
                  3
        胞，以 5×10 个/孔的密度接种于 96 孔板中（每孔 100
                                                           （Ibr-7剂量分别为2、4、8 μmol/L，Ibr、吉西他滨的剂量均
        μL），于 37 ℃、5％CO2条件下培养24 h后，将细胞随机分
                                                           为8 μmol/L，剂量设置依据参考“2.1.1”项）。每组设置3
        为空白对照组和给药组[Ibr、Ibr-7剂量均分别为1、2、4、8
                                                           个复孔。空白对照组加入RPMI 1640培养基2 mL，各给
        μmol/L，剂量设置参考本课题组前期试验的半数抑制浓
                                                           药组分别加入含相应药物的RPMI 1640培养基2 mL，于
        度（IC50 ）]。每组设置 3 个复孔。空白对照组加入 RPMI
                                                           37 ℃、5％CO2条件下培养24 h后，收集贴壁细胞。贴壁
        1640 培养基 200 μL，各给药组分别加入含相应药物的
                                                           细胞用PBS清洗2次后，依次加入AnnexinⅤ-FITC/PI细
        RPMI 1640培养基200 μL，于37 ℃、5％CO2条件下培养
                                                           胞凋亡检测试剂盒中的缓冲液 100 μL 以及 Annexin
        48 h 后，弃去培养基，每孔加入含 10％CCK-8 检测试剂
                                                           Ⅴ-FITC染液、PI染液各5 μL，混匀，染色15 min后，采用
        的RPMI 1640培养基100 μL，于37 ℃、5％CO2条件下培
                                                           流式细胞仪检测细胞凋亡情况，使用 FACSDiva v8.0.1
        养1 h。采用全波长多功能酶标仪于450 nm波长处检测
                                                           软件计算细胞总凋亡率[细胞总凋亡率（％）＝早期凋亡
        各孔的光密度（OD）值，并计算细胞存活率[细胞存活率
                                                           率+晚期凋亡率]。
       （％）＝给药组细胞的平均 OD 值/空白对照组细胞的平
                                                           2.4  JC-1染色法检测细胞内线粒体膜电位变化情况
        均 OD 值×100％]；采用 GraphPad Prism 5 软件计算 IC50。                                                 5
                                                               收集对数生长期的 Capan-2 细胞，以 2×10 个/孔的
        上述试验重复操作3次（下同）。
                                                           密度接种于6孔板中（每孔2 mL），于37 ℃、5％CO2条件
        2.1.2  细胞的药物敏感性         收集对数生长期的Capan-2
                                                           下培养24 h后，按“2.3”项下方法分组。每组设置3个复
        细胞，以 5×10 个/孔的密度接种于 96 孔板中（每孔 100                  孔。空白对照组加入RPMI 1640培养基2 mL，各给药组
                    3
        μL），于37 ℃、5％CO2条件下培养24 h后，将细胞随机分                   分别加入含相应药物的 RPMI 1640 培养基 2 mL，于
        为空白对照组和吉西他滨单用组（0.062 5、0.125、0.25、                 37 ℃、5％CO2下培养 16 h 后，用 0.25％胰蛋白酶-EDTA
        0.5、1 μmol/L）、紫 杉 醇 单 用 组（0.062 5、0.125、0.25、      消化液消化，收集细胞。细胞用 PBS 清洗 2 次后，加入
        0.5、1 μmol/L）、Ibr 单用组（1 μmol/L）、Ibr-7 单用组（1        RPIM 1640 培养基 500 μL 和 JC-1 工作液 500 μL，混匀，
        μmol/L）以及Ibr+吉西他滨联用组、Ibr-7+吉西他滨联用                  染色30 min后，采用流式细胞仪检测细胞膜电位变化情
        组、Ibr+紫杉醇联用组和Ibr-7+紫杉醇联用组（联用组剂                     况，使用 FACSDiva v8.0.1 软件计算细胞线粒体膜电位
        量均为 1 μmol/L+0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μmol/L），各    下降比例。
        给药组剂量设置均参考本课题组前期预试验结果。每                            2.5 Western blotting法检测细胞中凋亡相关蛋白的表
        组设置 3 个复孔。空白对照组加入 RPMI 1640 培养基                    达情况
        200 μL，各给药组分别加入含相应药物的 RPMI 1640 培                      收集对数生长期的 Capan-2 细胞，以 2×10 个/孔的
                                                                                                    5
        养基 200 μL，于 37 ℃、5％CO2下培养 48 h 后，弃去培养              密度接种于6孔板中（每孔2 mL），于37 ℃、5％CO2条件
        基，每孔加入含10％CCK-8检测试剂的RPMI 1640培养                    下培养24 h后，按“2.3”项下方法分组。每组设置3个复
        基100 μL，于37 ℃、5％CO2条件下培养1 h后，按“2.1.1”              孔。空白对照组加入RPMI 1640培养基2 mL，各给药组
        项下方法测定并计算细胞存活率。                                    分别加入含相应药物的 RPMI 1640 培养基 2 mL，于


        中国药房    2019年第30卷第4期                                               China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 4  ·501  ·
   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80