Page 64 - 2019年2月第30卷第4期

荧光法进行鉴定。将细胞置于 4％多聚甲醛中固定 15 严格按照相关试剂盒说明书操作。上述试验重复3次。
min，以胎牛血清封闭2 h后，加入GFAP一抗（1∶100），于 2.7 统计学方法
4 ℃反应24 h后，用PBS反复冲洗4次，每次15 s；随后加 采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。计量资
入经 FITC 标记的相应二抗（1 ∶ 100），于 37 ℃下避光反 料以 x±s 表示，采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异
应 1 h，用 DAPI 染料 60 μL 染核 3 min 后，以中性树脂封 有统计学意义。
片，于显微镜下观察并拍照，观察细胞的形态与分布 3 结果
[GFAP 染色阳性（即发出绿色荧光），且细胞扁平，可见 3.1 星形胶质细胞鉴定结果
突起]。 成熟星形胶质细胞胞体饱满、体形较大，胞质、突起
2.3 分组、给药和造模 清晰，胞核呈空泡状（见图1A）；经DAPI染色后，胞核呈
4
取对数生长期细胞，以 5×10 个/mL 的密度接种至 椭圆形、间隔均匀，胞质、突起、胞核清晰（见图1B）；将图
24 孔板中，于 37 ℃、5％CO2 培养箱中培养 24 h 后，随 1A、图1B进行实时叠合后，可见细胞形态和分布均符合
机分为正常组、模型组、阳性对照组（尼莫地平10 μmol/L） 星形胶质细胞特征，且两者完全重合，提示其为星形胶
和知母皂苷 B 低、中、高剂量组（1、10、100 μmol/L），各 质细胞，且纯度较高（见图1C）。
给药组剂量均参照本课题组前期预试验结果。每组设
置9个复孔。正常组和模型组细胞均加入不含药物的完
全培养基1 000 μL，各给药组加入含相应药物的完全培
养基 1 000 μL，于 37 ℃、5％CO2培养箱中培养 24 h。正
常组细胞加入含糖 EBSS 400 μL，于 37 ℃、5％CO2培养
箱中培养2 h，随后更换为完全培养基，于37 ℃、5％CO2
细胞培养箱中培养 48 h。其余各组细胞均采用氧糖剥
A. GFAP B. DAPI C. DAPI+GFAP
夺/再灌注法复制缺氧/复氧损伤模型：先加入不含糖
图1 星形胶质细胞荧光染色显微图（×200）
EBSS 400 μL，于37 ℃、94％N2、5％CO2、1％O2培养箱中 Fig 1 Micrograms of astrocyte fluorescence staining
培养 2 h，进行缺氧处置；随后更换为完全培养基，于 （×200）
37 ℃、5％CO2培养箱中培养48 h，进行复氧恢复。 3.2 知母皂苷B对细胞损伤的影响
2.4 知母皂苷B对细胞损伤的影响考察 与正常组比较，模型组细胞中的 LDH 相对释放率
按“2.3”项下方法分组、给药并复制缺氧/复氧损伤 显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比
星形胶质细胞模型。复氧后，取各组细胞培养液20 μL， 较，知母皂苷B各剂量组和阳性对照组细胞中的LDH相
采用比色法以酶标仪检测其 LDH 漏出率，并计算各组 对释放率均显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05或
LDH 相对释放率以评价细胞损伤程度（LDH 相对释放 P＜0.01），详见表1。
率＝给药组或模型组细胞的LDH漏出量/正常组细胞的 表 1 知母皂苷 B 对缺氧/复氧损伤星形胶质细胞 LDH
LDH漏出量×100％）。上述试验重复3次。 相对释放率和细胞相对活力的影响（x±±s，n＝3）
2.5 知母皂苷B对细胞活力的影响考察 Tab 1 Effects of anemarsaponin B on relative release
按“2.3”项下方法分组、给药，并复制缺氧/复氧损伤 rate of LDH and relative viability in hypoxia/
星形胶质细胞模型。复氧后，各组细胞均加入 MTT 试 reoxygenation injury astrocytes（x±±s，n＝3）
剂（15 μL/孔），于 37 ℃下培养 4 h，弃去上清液，加入 组别 LDH相对释放率，％ 细胞相对活力，％
DMSO（150 μL/孔），于37 ℃下振荡10 min，采用酶标仪 正常组 100.00±0.00 100.00±0.00
模型组 356.23±21.42 ＊＊ 15.12±3.49 ＊＊
于 570 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值，并计算相 知母皂苷B低剂量组 259.72±15.48 # 25.01±4.71 #
对细胞活力（细胞相对活力＝给药组或模型组细胞的平 知母皂苷B中剂量组 198.98±8.57 ## 44.99±8.15 #
均 OD 值/正常组细胞的平均 OD 值×100％）。上述试验 知母皂苷B高剂量组 154.77±13.62 ## 70.21±6.97 ##
阳性对照组 137.32±9.83 ## 82.54±8.36 ##
重复3次。
＊ ＊
#
注：与正常组比较， P＜0.05， P＜0.01；与模型组比较，P＜
＊
2.6 知母皂苷B对细胞中相关指标含量的影响考察
##
0.05，P＜0.01
按“2.3”项下方法分组、给药，并复制缺氧/复氧损伤
＊
＊ ＊
Note：vs. normal group， P＜0.05， P＜0.01；vs. model group，
星形胶质细胞模型。复氧后，取各组细胞培养液适量， # P＜0.05，P＜0.01
##
采用 ELISA 法以酶标仪于 450 nm 波长处测定各孔的 3.3 知母皂苷B对细胞活力的影响
OD 值，并计算其中 AQP-4、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量， 与正常组比较，模型组的细胞相对活力显著减弱，
·490 · China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 4 中国药房 2019年第30卷第4期