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脑卒中分为出血性卒中（占20％）和缺血性卒中（占                       建成生物工程研究所，批号依次为：A1003、A0101、
        80％），严重威胁人类的健康。脑水肿作为脑卒中的                           A0104、A0106、A0107）；兔抗小鼠胶质纤维酸性蛋白
        主要并发症之一，是导致患者残疾甚至死亡的主要原                            （GFAP）一抗、经异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔
        因 [1-3] 。针对脑水肿，临床上大多采用手术清除、脱水等                     荧 光 二 抗（美 国 Abcam 公 司 ，批 号 分 别 为 ab7261、
                           [4]
        治疗方法，但疗效有限 。故寻找有效治疗脑水肿的方                           ab150078）；4′，6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）染料（江苏碧
        法成为了目前研究的热点之一。在中枢神经系统                              云天生物技术有限公司，批号：C1005）；含糖 Earle’s 平
       （CNS）中，星形胶质细胞作为数量最多的神经胶质细                           衡盐溶液（EBSS）、不含糖 EBSS（国药集团化学试剂有
        胞，具有抗氧化应激、合成神经递质等多种重要功能，可                          限公司，pH 分别为 7.4、7.3，批号依次为：20160719、
                                 [5]
        作为治疗中枢性疾病的靶点 。水通道蛋白 4（AQP-4）                       20160712）；二甲亚砜（DMSO）等试剂均为分析纯，水为
        是由星形胶质细胞分泌的一种蛋白质，其表达水平可影                           纯净水。
        响细胞中水分的含量，与脑水肿的发生密切相关                     [6-9] ；同  1.3 动物
        时有研究发现，在发生脑缺血/再灌注损伤后，大脑组织                              SPF级雄性SD大鼠，新生48 h内，由重庆医科大学
       （主要为星形胶质细胞）产生的大量炎症因子[如肿瘤坏                           实验动物中心提供[生产许可证号：SCXK（渝）2012-
        死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）等]可影响脑水肿                   0001]。
        的形成与发展      [10-11] ，并可促使AQP-4过表达，进一步加重            2 方法
        脑水肿 。由此可见，AQP-4 及相关炎症因子可能在脑                        2.1 原代新生SD大鼠星形胶质细胞的培养、纯化、传代
              [12]
        水肿的发生发展过程中发挥重要作用。                                  2.1.1  原代培养     按照文献[14]方法进行原代培养。选
            知母皂苷是百合科植物知母（Anemarrhena aspho-                择新生48 h内的乳鼠，断头、取脑，剥离海马体、脑膜，得
        deloides Bge.）干燥根茎的主要成分。其中，知母皂苷 B                  大脑皮层，用 PBS 清洗后，置于干净培养皿中，剪碎，加
        为主要活性成分，具有抑制自由基生成、修复神经元损                           入 2～3 倍体积的 0.25％胰蛋白酶，于 37 ℃下消化 15
                                        [13]
        伤等药理作用，具有很大的开发价值 。为此，本课题                           min 后，用等体积完全培养基（即含 10％胎牛血清的
        组以缺氧/复氧损伤星形胶质细胞为对象，通过检测知母                          DMEM/F12 培养基，下同）终止反应；过 200 目筛，1 000
        皂苷B对其AQP-4及IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影响，初                 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀以适量完全培养基重
        步探索知母皂苷B对缺氧/复氧神经细胞的保护作用，以                          悬，经吹打、分散后，得单细胞悬液。用适量完全培养基
        期为脑缺血/再灌注损伤提供治疗新策略。                                重悬上述单细胞悬液，按约2×10 个/mL的密度接种于玻
                                                                                       6
        1 材料                                               璃培养瓶中，于 37 ℃、5％CO2培养箱中培养，于接种后
        1.1  仪器                                            的1～2 d更换培养基，随后每周更换2次，并每天用倒置
            Heal Force 型细胞培养箱（力康生物医疗科技控股                   相差显微镜观察细胞形态。
        有限公司）；HEPA Class 100型缺氧培养箱（美国Thermo                2.1.2  细胞纯化      待细胞长满至融合（约接种后 7～10
        Fisher Scientific公司）；CKX41型倒置相差显微镜（日本              d），将其置于摇床中，于 37 ℃下以 250 r/min 振荡 24 h；
        Olympus公司）；TGL-16G型高速冷冻离心机（日本Hita-                 弃去上清液，用0.25％胰蛋白酶消化，以1 000 r/min离心
        chi公司）；Synergy 2型酶标仪（美国BioTek公司）；TXT3              5 min；弃去上清液，沉淀用适量完全培养基重悬后，于
        型细胞离心机（北京汗盟紫星仪器仪表有限公司）；                            37 ℃、5％CO2培养箱中继续培养。为提高细胞的纯度，
        NRV-200型摇床（上海南荣实验室设备有限公司）。                         可待细胞再次融合时，重复上述操作。
        1.2 药品与试剂                                          2.1.3  细胞传代      取培养 14 d 左右的细胞，弃去培养
            知母皂苷 B 原料药（上海信裕生物科技有限公司，                       基，用PBS清洗2次，用0.25％胰蛋白酶消化直至细胞间
        批号：20160926，纯度：＞98％）；尼莫地平注射液（青岛                    隙增加；用完全培养基终止消化，并摇动、吹打细胞悬
        金峰制药有限公司，批号：20170105，规格：50 mL ∶ 10                 液，分别将其接种至另外2个培养瓶中，于37 ℃、5％CO2
        mg）；四甲基偶氮盐（MTT）试剂（郑州派尼化学试剂厂，                       培养箱中继续培养。每天用倒置相差显微镜观察细胞
        批号：161201）；0.25％胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS，美                  生长状态，视情况添加、补充、更换培养基，并最终选用
        国 Sigma 公司，pH 为 7.4，批号分别为 h0032、h0012）；            纯度较高的第二代星形胶质细胞进行后续试验。
        DMEM/F12 培养基（美国 Gibico 公司，批号：h0010）；胎              2.2 星形胶质细胞的鉴定
        牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号：                                将“2.1”项下经传代、纯化后的星形胶质细胞以 5×
                                                             4
        HB0204）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒和 AQP-4、IL-6、                 10 个/mL 的密度接种至 24 孔板中，于 37 ℃、5％CO2培
        IL-1β、TNF-α酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（南京                   养箱中培养24 h后，进行标志蛋白GFAP染色，使用免疫


        中国药房    2019年第30卷第4期                                               China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 4  ·489  ·
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