Page 74 - 2019年1月第30卷第2期
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算细胞存活率。细胞存活率（％）＝（OD 试验组/OD 空白对照组 ）×                比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
        100％。                                              3 结果
        2.3 TET对NB细胞迁移、侵袭能力的影响考察                           3.1 TET对NB细胞的细胞毒性
        2.3.1 NB 细胞迁移实验         取对数生长期的 IMR-32 细               结果显示，不同浓度的 TET 对 IMR-32 细胞和 SH-
        胞和 SH-SY5Y 细胞并分为正常对照组、TET组，经胰酶                     SY5Y 细胞的增殖均有抑制作用，并随 TET 浓度增加该
        消化，无血清培养基重悬细胞并计数，调整细胞密度为                           抑制作用有增强趋势。与空白对照比较，当TET浓度为
             5
        1.0×10 个/mL。在Transwell上室加入细胞悬液200 μL，              5～20 μmol/L时，细胞存活率随着药物浓度的增加而显
        然后根据 TET 细胞毒性考察结果分别加入终浓度为 0                        著降低，差异有统计学意义（P＜0.05 或 P＜0.01）；TET
        μmol/L（正常对照组）、10 μmol/L（IMR-32细胞，TET组）             对 IMR-32 细胞和 SH-SY5Y 细胞的半数抑制浓度（IC50 ）
        或15 μmol/L（SH-SY5Y细胞，TET组）的TET甲醇溶液；                分别为10.148、14.461 μmol/L。根据IC50数据，并考虑到
        下室加入含 10％胎牛血清的细胞培养基 800 μL。各组                      尽量减少药物自身对肿瘤细胞的毒性作用，故后续实验
        细胞置于37 ℃、5％CO2培养箱培养24 h后，取出小室用                     中 TET 对 IMR-32 细胞和 SH-SY5Y 细胞的处理浓度分
        棉签擦拭上室，以 4％多聚甲醛固定 15 min，再以 0.1％                   别设为10、15 μmol/L。不同浓度TET作用后IMR-32细
        结晶紫溶液染色20 min，取出用PBS清洗并使用棉签擦                       胞和SH-SY5Y 细胞的存活率见图1。
        拭上室。在光学显微镜下随机挑选5个不同视野，拍照                              150                    150
        并计数跨膜细胞。                                             ％  100     ＊           ％  100    ＊
        2.3.2 NB细胞侵袭实验         取Matrigel基质胶，以无血清             细胞存活率，       ＊＊        细胞存活率，        ＊  ＊＊
        培养基按照体积比8 ∶ 1稀释，按50 μL/孔均匀铺在Tran-                      50            ＊＊  ＊＊   50               ＊＊
        swell小室上室，置于37 ℃、5％ CO2培养箱放置4～6 h待                     0                      0
                                                                  0  2.5  5  10  15  20  0  2.5  5  10  15  20
        凝固。取对数生长期的 IMR-32 细胞和 SH-SY5Y 细胞，                            TET浓度，μmol/L           TET浓度，μmol/L
                                                                     A. IMR-32细胞            B. SH-SY5Y细胞
        按照“2.3.1”项下方法分组，并按“经胰酶消化……0.1％                         注：与空白对照比较，P＜0.05， P＜0.01
                                                                                    ＊＊
                                                                             ＊
        结晶紫溶液染色20 min，取出用PBS清洗并使用棉签擦                           Note：vs. blank control group， P＜0.05， P＜0.01
                                                                                  ＊
                                                                                         ＊＊
        拭上室”等步骤同法操作。在光学显微镜下随机挑选 5                          图 1   不同浓度 TET 作用后 IMR-32 细胞和 SH-SY5Y
        个不同视野，拍照并计数跨膜细胞。                                         细胞的存活率
        2.4  TET对NB细胞相关蛋白表达水平的影响考察                         Fig 1  Survival rates of IMR-32 cell and SH-SY5Y cell
            采 用 Western blotting 法 检 测 。 取 对 数 生 长 期              after treated with different doses of TET
        IMR-32 细胞和 SH-SY5Y 细胞，按照“2.3.1”项下方法分               3.2  TET对NB细胞迁移、侵袭能力的影响
        组，经胰酶消化，1 500 r/min 离心 15 min 后以 4.0×10        5   3.2.1  细胞迁移实验结果          细胞计数结果显示，正常对
        个/mL接种于6孔板内，待细胞贴壁后分别加入终浓度                          照组 IMR-32 细胞和 SH-SY5Y 细胞的跨膜数分别为
        为 0 μmol/L（正常对照组）、10 μmol/L（IMR-32 细胞，             （163.02±6.24）个、（118.13±7.50）个，TET 组 IMR-32 细
        TET组）或15 μmol/L（SH-SY5Y细胞，TET组）的TET甲               胞和 SH-SY5Y 细胞的跨膜数分别为（68.32±3.51）个、
        醇溶液，置于37 ℃、5％CO2培养箱培养24 h。使用RIPA                   （61.24±5.03）个。与正常对照组比较，TET组跨膜细胞
        裂解液裂解并提取总蛋白，以 BCA 法测定蛋白浓度以                         数均显著减少，差异均有统计学意义（P＜0.01）。各组
        确定上样浓度。所获蛋白以上样缓冲液×6 作变性处理                          NB 细胞迁移实验显微图见图 2，跨膜细胞数柱形图见
        后，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶                      图3。
        电泳分离，110 V 电压转膜；使用 5％脱脂奶粉封闭 1 h，                   3.2.2  细胞侵袭实验结果          细胞计数结果显示，正常对
        加 MMP-2 抗 体（1 ∶ 1 000）、MMP-9 抗 体（1 ∶ 1 000）、       照组 IMR-32 细胞和 SH-SY5Y 细胞的跨膜数分别为
        β-catenin抗体（1∶1 000）、GSK3β抗体（1∶1 000）、p-GSK3       （401.43±10.96）个、（182.28±5.56）个，TET 组 IMR-32
        β抗体（1 ∶ 1 000）及β-actin抗体（1 ∶ 2 000），在4 ℃下摇床        细胞和 SH-SY5Y 细胞的跨膜数分别为（206.12±8.83）
        孵育过夜；次日用 TBST 缓冲液漂洗 10 min×3 次，加入                  个、（83.35±3.60）个。与正常对照组比较，TET 组跨膜
        辣根过氧化酶标记抗体（二抗，1 ∶ 8 000），摇床上慢速常                    细胞数均显著减少，差异均有统计学意义（P＜0.01）。
        温孵育 1 h；TBST 缓冲液漂洗 10 min×3次，加入ECL试                各组NB细胞侵袭实验显微图见图4，跨膜细胞数柱形图
        剂显影。采用Quantity One 4.6.4分析软件测定条带灰度                 见图5。
        值，以目的蛋白与内参β-actin蛋白比较所得的相对灰度                       3.3 TET 对 NB 细胞中 MMP-2、MMP-9 的蛋白表达水
        值表示目的蛋白表达水平。                                       平的影响
        2.5  统计学方法                                             与正常对照组比较，TET组IMR-32细胞和SH-SY5Y
            应用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。数据均                     细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均显著降低，差异
        以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两                         均有统计学意义（P＜0.01）。各组 NB 细胞中 MMP-2、


        中国药房    2019年第30卷第2期                                               China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 2  ·213  ·
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