Page 79 - 2019年1月第30卷第2期
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氧化物酶标记山羊抗鼠免疫球蛋白 G（IgG）（美国 Pro-                      100 ∶ 1）进行处理，将裂解后的样品进行涡旋震荡、4 ℃下
        teintech 公 司）；RIPA 组 织 裂 解 液 、苯 甲 基 磺 酰 氟           12 000 r/min离心，吸取上清液得到肝组织总蛋白。肝组
        （PMSF）、十二烷基磺酸钠（SDS）、二喹啉甲酸（BCA）蛋                     织总蛋白以 BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，再经
        白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；电化学                           变性处理后采用SDS分离胶套装进行分离（根据目的蛋
        发光法（ECL）Plus发光液（北京Bridgen桥生物公司）；其                   白IL-10 和 TNF-α的分子量大小选择 12％分离胶和 5％
        余试剂均为分析纯或实验室常用规格，水为去离子水。                            浓缩胶），湿法转膜，再以洗膜液配制的 5％脱脂奶粉
        1.3 动物                                              溶液在 4 ℃下封闭过夜；然后加入鼠 TNF-α单克隆抗
            健康雄性SD大鼠60只，体质量180～220 g，由桂林                    体（1∶2 500）、鼠IL-10单克隆抗体（1∶2 500）、鼠β-actin单
        医学院实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK                           克隆抗体（1 ∶ 1 000），在 4 ℃下孵育过夜；以 TBS 缓冲液
                                                            洗涤 3 次后，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠 IgG
        （桂）2016-0001。实验期间动物自由摄食和饮水，并保
                                                           （二抗，1∶5 000），于室温下孵育1 h；以TBS缓冲液洗涤3
        持室内温度为18～22 ℃、相对湿度为40％～60％。
                                                            次后，采用化学发光仪进行发光显影，检测蛋白条带。采
        2 方法
                                                            用Image J 2X软件对蛋白条带进行灰度分析，以目标蛋白
        2.1 分组、造模、给药与取样
                                                            条带灰度值与内参β-actin条带灰度值之比表示目标蛋白
            取大鼠60只，随机分为空白对照组、模型组、阳性对
                                                            的表达水平。
        照组和甘草水提物低、中、高剂量组，每组10只。取甘草
                                                            2.5 统计学方法
        水 提 物 、雷 公 藤 甲 素 、异 甘 草 酸 镁 ，以 二 甲 基 亚 砜
                                                                采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资
        （DMSO）充分溶解（DMSO 体积比均小于 1％），然后以
                                                            料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
        生理盐水稀释至适当浓度。空白对照组、模型组大鼠均
                                                            比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
        灌胃等容生理盐水，阳性对照组大鼠灌胃异甘草酸镁药
                                                            3 结果
        液（13.5 mg/kg，剂量根据本课题组前期研究及文献[6]设
                                                            3.1  甘草水提物对雷公藤甲素致急性肝损伤模型大鼠
        置），甘草水提物低、中、高剂量组大鼠灌胃甘草水提物
                                                            肝组织病理学的影响
        药液（120、240、480 mg/kg，剂量根据临床用量换算结果                       空白对照组大鼠肝组织细胞结构明显清晰，细胞核
        设置，以提取物量计），给药体积均为1 mL，每天1次，连                        大且圆，核膜清晰且核仁明显，无细胞变性坏死现象；模
        续给药7 d。第8天时，除空白对照组大鼠灌胃等体积生                          型组大鼠肝组织细胞高度肿胀，胞质透亮，排列紊乱，肝
        理盐水外，模型组、阳性对照组和甘草水提物各剂量组大                           窦受压消失；阳性对照组大鼠肝组织细胞未见明显肿
        鼠均一次性灌胃雷公藤甲素药液（0.6 mg/kg，剂量根据本                      胀，排列较整齐，肝窦可见；甘草水提物低剂量组大鼠肝
        课题组前期研究及文献[6]设置）以建立急性肝损伤模型。                         组织部分细胞稍肿胀，排列较紊乱，肝窦不太明显；甘草
            第 9 天实验结束后，于各组大鼠腹主动脉采血 3                        水提物中、高剂量组大鼠肝组织细胞肿胀不明显，排列
        mL，3 000 r/min 离心 10 min 后，取其上层血清约 1 mL，            较整齐，肝窦可见。各组大鼠肝组织病理学变化显微图
        于－20 ℃条件下保存。处死所有大鼠，迅速剖取肝脏相                          见图1。
        同部位组织，以生理盐水漂洗后，一部分用作组织病理
        学检查，另一部分存于冻存管投于液氮并在－80 ℃条件
        下保存。通过检测大鼠血清肝功能指标并观察其肝组
        织病理学变化，确定其急性肝损伤模型是否成功建立。
        2.2 大鼠肝组织病理学观察                                          A.空白对照组          B.模型组          C.阳性对照组
            采用苏木精-伊红（HE）染色法检查。取大鼠肝右叶
        相同部位约1 cm×1 cm×0.5 cm 的组织小块，放入10％甲
        醛溶液中固定，然后脱水、透明、石蜡包埋，进行常规切
        片及HE染色。在显微镜下观察肝组织病理学变化。                              D.甘草水提物低剂量组     E.甘草水提物中剂量组     F.甘草水提物高剂量组
        2.3 大鼠血清肝功能指标检测                                     图 1  各组大鼠肝组织病理学变化显微图（HE 染色，×
            取大鼠血清样品送至桂林医学院附属医院检验科，                               200）
        采用酶偶联法检测丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨                          Fig 1 Pathological micrographs of liver tissue of rats
        酶（AST）活性。                                                 in each group（HE staining，×200）
        2.4  大鼠肝组织中IL-10、TNF-α的蛋白表达水平检测                     3.2  甘草水提物对雷公藤甲素致急性肝损伤模型大鼠
            采用 Western blotting 法进行检测。取大鼠肝组织                血清肝功能指标的影响
        50 mg，以 RIPA 组织裂解液-PMSF 混合液（体积比为                        与空白对照组比较，模型组大鼠血清中 AST、ALT


        ·218  ·  China Pharmacy 2019 Vol. 30 No. 2                                   中国药房    2019年第30卷第2期
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