Page 33 - 2019年1月第30卷第2期

11208，纯度：＞99％）；磺胺苯吡唑对照品（批号：SL- 孵育5 min后，加入肝微粒体5 μL启动反应。
BC7923V，纯度：＞99％）、二乙基二硫代氨基甲酸钠对 2.3.2 样品处理 取孵育后的样品200 μL，于不同时间
照品（批号：MKBJ4989V，纯度：99％）均购自美国Sigma 点加入4 ℃甲醇（含内标10 ng/mL）400 μL终止反应，涡
公司；α-萘黄酮对照品（东京化成工业株式会社，批号： 旋混匀3 min后，于4 ℃下以13 000 r/min离心15 min，取
UEESA-JQ，纯度：＞98.0％）；甲醇、乙腈均为色谱纯，其 上清液适量进行UPLC-MS/MS分析。
余试剂均为分析纯，水为纯化水。 2.4 方法学考察
2 方法与结果 2.4.1 专属性考察 取人肝微粒体适量，经高温灭活
2.1 色谱与质谱条件 后，分别按“2.3”项下方法制备不含待测物和内标的空白
2.1.1 色谱条件 色谱柱：Acquity UPLC TM CSH C18 对照样品、含上述物质的样品以及体外代谢稳定性研究
（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：0.1％甲酸溶液（A）- 孵育样品（人肝微粒体，孵育5 min时的样品），再按“2.1”
甲醇（B），梯度洗脱（0～2 min，80％B→90％B；2～5 min， 项下色谱与质谱条件进样分析，记录色谱图。结果显
90％B）；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：2 μL。 示，辣薄荷基厚朴酚和内标的保留时间分别为 4.68、
2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；离子喷雾电压： 2.33 min，分离度良好，且没有受到空白基质的干扰，表
5.5 kV；离子源温度：500 ℃；气帘气压力：20 psi。采用 明本法专属性强，详见图2。
6×10 4
多反应监测（MRM）模式扫描，正离子方式检测。用于 2 000 4×10 4
定量分析的离子对分别为m/z 401.2→331.1（辣薄荷基厚 1 000 2×10 4 1
朴酚）和m/z 265.1→247.0（内标），碰撞能量（CE）分别为 cps 强度， 0 1.0 2.0 3.0 4.0 cps 强度， 8×10 0 6 1.0 2.0 3.0 4.0
38、30 eV，去簇电压（DP）均为 130 V；离子束聚焦电压 300 6×10 6
200 4×10 6
（EP）：10 V；碰撞池出口电压（CXP）：10 V；驻留时间： 100 2×10 6 2
0.20 s。 0 1.0 2.0 3.0 4.0 0 1.0 2.0 3.0 4.0
2.2 溶液的配制 时间，min 时间，min
A.空白对照样品 B.内标+辣薄荷基厚朴酚样品
2.2.1 辣薄荷基厚朴酚贮备液及系列工作液 取辣薄 6×10 4
4×10 4
荷基厚朴酚对照品 10.00 mg，精密称定，用甲醇定容至
2×10 4 1
10 mL棕色量瓶中，混匀，即得质量浓度为1 mg/mL的辣 cps 0 1.0 2.0 3.0 4.0
薄荷基厚朴酚贮备液，于 4 ℃冰箱中密封保存，备用。 强度， 3×10 6
2×10 6
临用前，用甲醇逐级稀释至相应质量浓度，即得辣薄荷
1×10 6 2
基厚朴酚系列工作液。 0 1.0 2.0 3.0 4.0
2.2.2 内标贮备液及内标溶液 取内标对照品 10.00 时间，min
C.体外代谢稳定性研究孵育样品
mg，精密称定，用甲醇定容至 10 mL 棕色量瓶中，混匀， 注：1.内标；2.辣薄荷基厚朴酚
即得质量浓度为1 mg/mL的内标贮备液，于4 ℃冰箱中 Note：1. internal standard；2. piperitylmagnolol
密封保存，备用。临用前，用甲醇稀释至相应质量浓度， 图2 典型MRM图
即得内标溶液。 Fig 2 Typical MRM chromatograms
2.2.3 特异性抑制剂溶液 分别取细胞色素P450 （CYP） 2.4.2 标准曲线的绘制与定量下限的考察 按“2.2.1”
酶抑制剂硝酸毛果芸香碱、奎尼丁、盐酸噻氯匹定、酮康 项下方法配制辣薄荷基厚朴酚系列工作液，分别量取上
唑、磺胺苯吡唑、二乙基二硫代氨基甲酸钠、α-萘黄酮对 述工作液2 μL，加入PBS 200 μL，混匀，加至经高温灭活
照品各10.00 mg，精密称定，用甲醇分别定容至10 mL棕 的人肝微粒体中，制得辣薄荷基厚朴酚质量浓度分别
色量瓶中，混匀，即得质量浓度均为 1 mg/mL 的特异性 为 3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00
抑制剂贮备液，于4 ℃冰箱中密封保存，备用。临用前， ng/mL 的系列标准样品，按“2.3”项下方法处理后，再按
用甲醇稀释至相应质量浓度，即得特异性抑制剂溶液。 “2.1”项下色谱与质谱条件进样分析，记录峰面积。以待
2.3 样品孵育与处理 测物质量浓度为横坐标（x）、待测物与内标的峰面积比
2.3.1 样品孵育 参照文献[8]配制孵育体系。其总体 值为纵坐标（y），采用加权法（加权系数为1/x）进行线性
积为 200 μL，包含磷酸盐缓冲液（PBS，100 mmol/L，pH 回归，得回归方程为 y＝0.409 6x+0.069 9（R ＝0.999 6）。
2
7.4）188 μL 和 NADPH 孵育系统 12 μL（含 A 液 10 μL 和 结果表明，辣薄荷基厚朴酚质量浓度检测的线性范围为
B液2 μL），于冰浴上混合而得（现用现配），随后加入质 3.91～500.00 ng/mL，定量下限为3.91 ng/mL。
量浓度为 100 μg/mL 的辣薄荷基厚朴酚工作液（该孵育 2.4.3 精密度与准确度试验 按“2.4.2”项下方法配制
体系中甲醇的体积分数应低于 1％），于 37 ℃水浴中预 辣薄荷基厚朴酚低、中、高质量浓度（7.81、62.50、400.00

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