Page 40 - 《中国药房》2026年10期
P. 40

获取SMILES编号，再通过SwissTargetPrediction数据库              2.2.3 实验分组与给药
         （http：//www.swisstargetprediction.ch/）预测靶点；合并上           实验分为 6 组，分别为：（1）空白血清对照（CON）
          述靶点去重后用 UniProt 数据库（https：//www.uniprot.            组，含 Huh-7 细胞+含 30% 空白血清的基础培养基；（2）
          org/）统一为基因名，获得柴芪益肝颗粒药物靶点。从铁                         柴芪益肝颗粒含药血清组（CQYGKL 组），含 Huh-7 细
          死亡数据库 FerrDb（http：//www.zhounan.org/ferrdb/）获       胞+含 30% 柴芪益肝颗粒含药血清（根据“2.2.2”项下结
          取铁死亡靶点；同时，从GeneCards数据库（https：//www.                果设置）的基础培养基；（3）铁死亡诱导剂（RSL3）组，含
          genecards. org/）和 OMIM 数 据 库（https：//www. omim.     Huh-7 细胞+DMEM 完全培养基+RSL3（5 μmol/L）；（4）
          org/）以“liver cancer”为关键词检索肝癌疾病靶点，最后                 mTORC1抑制剂（RMC-5552）组，含Huh-7细胞+DMEM
          利用 R 软件中的 VennDiagram 包获取柴芪益肝颗粒-铁                   基础培养基+RMC-5552（10 μmol/L）；（5）mTORC1激动
          死亡交集靶点、柴芪益肝颗粒-肝癌交集靶点，以及柴芪                           剂（CCT007093）组，含Huh-7细胞+DMEM基础培养基+
          益肝颗粒-铁死亡-肝癌交集靶点。                                    CCT007093（25 μmol/L）；（6）CCT007093+CQYGKL 组，
          2.1.2 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建                               含 Huh-7 细胞+CCT007093（25 μmol/L）+含 30% 柴芪益
              将 柴 芪 益 肝 颗 粒 - 铁 死 亡 - 肝 癌 交 集 靶 点 导 入         肝颗粒含药血清的基础培养基。
          STRING数据分析平台（https：//string-db.org/），构建蛋白           2.2.4 细胞中铁死亡指标检测
          质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网             取对数生长期的Huh-7细胞，按“2.2.3”项下分组、给
          络，筛选关键靶点；然后，使用 Cytoscape 3.9.1 软件构建                 药，干预48 h（根据“2.2.2”项下结果设置，下同）后，收集
          药物-成分-靶点网络，并对其进行可视化分析，筛选主要                          CON 组、CQYGKL 组、RSL3 组细胞，置于离心管中，离
          有效成分。                                               心后弃上清液，超声波破碎细胞，于 4 ℃下以 8 000×g
          2.1.3 分子对接分析                                        离心10 min，取上清液，按试剂盒说明书操作，检测Fe 、
                                                                                                           2+
              将柴芪益肝颗粒的关键成分导入Chem3D软件，构                        MDA、GSH水平。实验重复6次。
          建其化学结构式并对其进行能量最小化处理，保存为                             2.2.5 细胞中mTOR、SREBP1、SCD1 mRNA表达检测
          PDB 格式文件；将关键靶点导入 PDB 数据库，下载对应                           采用荧光定量 PCR 法检测。取对数生长期的 Huh-
          蛋白的PDB格式文件，经去水分子、去小分子、加氢处理                          7 细胞，按“2.2.3”项下分组、给药，干预 48 h 后，采用
          后，保存为 PDBQT 格式文件。利用 PyMOL 和 MOE 软                   TRIzol 法 提 取 RNA 并 反 转 录 为 cDNA，采 用 SYBR
          件采用全原子对接方法进行分子对接，验证主要有效成                            Green 法进行定量 PCR。PCR 反应体系包含 TB Green
          分与关键靶点的结合活性。                                        Premix Ex Taq（Tli RNase HPlus）10 μL，正、反向引物各
          2.2 实验验证                                            0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，DNA 样本 2 μL，超
          2.2.1 空白血清及柴芪益肝颗粒含药血清制备                             纯水6 μL。PCR扩增条件如下：先95 ℃预变性30 s；再
              取 30 只 SPF 级雄性 SD 大鼠，随机分为空白组与柴                  95 ℃变性5 s、60 ℃退火延伸30 s，循环40次；最后95 ℃
          芪益肝颗粒组，每组15只。参照《药理试验方法学》中种                          作用5 s、60 ℃作用1 min、97 ℃作用1 s获取溶解曲线与
          属间体表面积换算原则（人与大鼠等效剂量换算系数为                            循 环 阈 值（cycle  threshold，Ct），每 组 重 复 3 次 。 以
          6.3），结合大鼠体重计算给药剂量。柴芪益肝颗粒组大                                               －ΔΔCt
                                                              GAPDH 为 内 参 ，采 用 2       法 计 算 mTOR、SREBP1、
          鼠灌胃柴芪益肝颗粒药液16.2 g/kg，用于制备柴芪益肝
                                                              SCD1 mRNA表达量。引物由上海闪锦生物科技有限公
          颗粒含药血清；空白组大鼠灌胃等体积生理盐水，用于
                                                              司设计并合成，引物序列和产物大小见表1。
          制备空白血清。两组大鼠均每日灌胃 2 次，连续 7 d，于                                 表1 待测引物序列和产物大小
          末次灌胃2 h后腹主动脉采血。血样于室温静置2 h，经
                                                              待测引物   正向引物序列（5′→3′）    反向引物序列（5′→3′）    产物大小/bp
          离心、56 ℃水浴灭活、0.22 μm 滤膜过滤后，分装保存                      mTOR   GCCTCATGGGATTTGGGAC  ATCAGCGAGTTCTTGCTATTCC  142
          于－20 ℃备用。                                           SREBP1  TCTGGAGGCATCGCAAGC  GAGGTTCCAGAGGAGGCTACA  149
          2.2.2 柴芪益肝颗粒含药血清给药浓度和干预时间筛选                         SCD1   TGATCCTCATAATTCCCGACG  TGGGCAGGATGAAGCACA  188
              采用 CCK-8 法检测细胞活力。取对数生长期 Huh-                    GAPDH  TGTTCCTACCCCCAATGTGTC  TGAAGTCGCAGGAGACAACC  158
                              4
          7 细胞，重悬后以 1×10 个/孔接种于 96 孔板中，分为对                    2.2.6 细胞中mTORC1/SREBP1/SCD1轴相关蛋白表达
          照孔（30%空白血清）及10%、20%、30%柴芪益肝颗粒含                      检测
          药血清孔，另设不含细胞和血清的调零孔，每个浓度设6                               采用 Western blot 法检测。取对数生长期的 Huh-7
          个复孔。每孔加入含相应血清的基础培养基100 μL，置                         细胞，按“2.2.3”项下分组、给药。干预48 h后，收集细胞，
          于 37 ℃、5%CO2培养箱中分别培养 24、48 h 后，每孔加                  裂解后提取总蛋白，并进行定量、加热变性、电泳分离、转
          入 10 μL CCK-8 试剂，继续孵育 3 h，使用酶标仪在 450                膜、封闭，加入 p-mTOR、mTOR、p-S6K、S6K、SREBP1、
          nm 波长下测定吸光度（A），计算细胞存活率：细胞存活                         SCD1、GAPDH 一抗（稀释比例均为 1∶1 000），于 4 ℃下
          率（%）＝（实验孔 A 值－调零孔 A 值）/（对照孔 A 值－调                   孵育过夜；次日加入相应二抗（稀释比例均为1∶3 000），
          零孔A值）×100%。筛选增殖抑制作用最为显著的柴芪                          于室温下孵育2 h；用ECL显影、成像。以目的蛋白与内
          益肝颗粒含药血清浓度及干预时间进行后续实验。                              参（GAPDH）的灰度值比值为目的蛋白的表达水平，并


          · 1274 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 10                            中国药房  2026年第37卷第10期
   35   36   37   38   39   40   41   42   43   44   45