Page 20 - 《中国药房》2026年10期
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于 ELISA 检测；随后，将大鼠处死，剖开胸腔，完整分离                                 表1 PCR引物序列及产物长度
          肺组织，用预冷的生理盐水冲洗后以滤纸吸干，取部分                            目的基因        序列（5′→3′）                  产物长度/bp
                                                              NLRP3       正向：CTCACCTCACACTCCTGCTG      122
          右肺上叶组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定；剩余肺组
                                                                          反向：AGAACCTCACAGAGCGTCAC
          织经分装后以液氮冷冻，再于－80 ℃下保存，用于后续                          GAPDH       正向：ACAGCAACAGGGTGGTGGAC      252
          其他检测。                                                           反向：TTTGAGGGTGCAGCGAACTT
          2.5 BALF中炎症因子水平检测                                   2.10 肺组织中 NLRP3/caspase-1/GSDMD 信号通路相
              采 用 ELISA 法 检 测 。 取“2.4”项 下 各 组 大 鼠 的           关蛋白表达检测
          BALF 适量（每组 6 只），按相应 ELISA 试剂盒说明书方                       采用Western blot法检测。取“2.4”项下各组大鼠冻
          法操作，使用酶标仪于 450 nm 波长下检测其中 IL-1β、                    存的肺组织适量（每组 3 只），以 RIPA 强裂解液裂解，提
          IL-18水平。                                            取总蛋白；采用BCA试剂盒检测蛋白浓度后，加热变性
          2.6 肺组织中氧化应激指标水平检测                                  15 min。取变性蛋白适量，进行10%十二烷基磺酸钠-聚
              采用生化法检测。取“2.4”项下各组大鼠冻存的肺                        丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转膜至聚偏二氟乙烯膜上，
          组织适量（每组6只），按相应试剂盒说明书方法操作，使                          以5%脱脂奶粉于室温下封闭1 h；洗膜后，加入NLRP3、
          用酶标仪分别于 532、450 nm 波长下检测其中 MDA、                     cleaved  caspase-1、caspase-1、GSDMD-N、GSDMD、
          SOD水平。                                              GAPDH一抗（稀释比例分别1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、
          2.7 肺组织病理学检查                                        1∶1 000、1∶1 000、1∶10 000），于 4 ℃下孵育过夜；洗膜
              采用 HE 染色法观察。取“2.4”项下各组大鼠经 4%                    后，加入相应二抗（稀释比例为 1∶10 000），于室温下孵
          多聚甲醛固定24 h的肺组织适量（每组3只），经梯度乙                         育 1 h；洗膜后，用 ECL发光液显影、成像。使用 Image J
          醇脱水、透明、石蜡包埋后切片（厚度约4 μm）。取适量                         软件对各个条带进行灰度值分析，以目的蛋白与内参蛋
          组织切片，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化处理后，进行                            白（GAPDH）灰度值的比值作为该目的蛋白的相对表
          HE染色（包括苏木精染色、盐酸-乙醇分化、水洗返蓝、伊                         达量。
          红染色等步骤）；经中性树胶封片后，置于光学显微镜下                           2.11 统计学方法
          观察其肺组织病理学变化。                                            采用GraphPad Prism 10软件对数据进行统计分析。
          2.8 肺组织细胞凋亡情况检测                                     符合正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用

              采用TUNEL染色法检测。取“2.7”项下各组大鼠的                      单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验（方差
          肺组织切片，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，加入柠檬                           齐）或 Dunnett’s T3 检验（方差不齐）。不符合正态性分
          酸缓冲液进行抗原修复；随后，依次以蛋白酶 K 孵育 20                        布的计量资料以 M（P25，P75 ）表示，多组间比较采用
          min、Triton 试剂孵育 8 min、TUNEL 反应液孵育 1 h，再             Kruskal-Wallis H 检验，进一步两两比较采用 Dunn’s 检
          以 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核；洗涤后，以抗                    验。检验水准α＝0.05。
          荧光淬灭封片液封片，使用荧光显微镜观察细胞凋亡情                            3 结果
          况（细胞核呈蓝色荧光，凋亡细胞呈绿色荧光），并采用                           3.1 STPC对哮喘大鼠行为学的影响
          Image J软件分析TUNEL凋亡细胞率（TUNEL凋亡细胞                         空白组大鼠精神状态良好，反应灵敏，皮毛顺滑有
          率＝凋亡细胞数/细胞总数×100%）。每张切片随机选                          光泽，饮食饮水正常，体重增长平稳。与空白组相比，模
          取3个视野进行观察，结果取平均值。                                   型组大鼠在雾化激发后，可见抓耳挠腮、频繁打喷嚏、挠
          2.9 肺组织中NLRP3 mRNA表达检测                              鼻、烦躁不安、呼吸急促、腹肌明显收缩、点头呼吸，可闻
              采用 RT-qPCR 法检测。取“2.4”项下各组大鼠冻存                   及明显痰鸣音，并伴有活动减少、精神萎靡、动作迟缓、
          的肺组织适量（每组6只），按提取试剂盒说明书方法提                           体重增长缓慢甚至有所下降的症状。与模型组相比，
          取其总 RNA 并测定其浓度、纯度；然后，按逆转录试剂                         STPC各剂量组及地塞米松组大鼠的上述症状均有不同
          盒说明书方法操作，将 RNA 逆转录成 cDNA，配制相应                       程度改善。
          反应体系后进行PCR扩增，具体反应条件如下：95 ℃预                         3.2 STPC对哮喘大鼠BALF中炎症因子水平的影响
          变性 30 s；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火/延伸 30 s，共 40 个               与空白组相比，模型组大鼠BALF中IL-1β、IL-18水
          循 环 。 以 GAPDH 为 内 参 ，以 2      －ΔΔCt  法 计 算 NLRP3    平均显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，各药物组大鼠
          mRNA的相对表达量，结果以空白组为参照进行归一化                           BALF 中IL-1β、IL-18水平均显著降低（P＜0.01）。结果
          处理。PCR引物序列及产物长度见表1。                                 见表2。


          · 1254 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 10                            中国药房  2026年第37卷第10期
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