Page 32 - 《中国药房》2026年9期

TriQuick 试剂充分研磨后提取总 RNA，并检测总 RNA β-actin作为内参，计算目的蛋白与内参蛋白的灰度值比
浓度及纯度，然后将总 RNA 逆转录为 cDNA；以 cDNA 值，以反映目的蛋白的表达水平；再计算p-AKT与AKT
为模板进行 PCR 扩增，PCR 扩增条件为 95 ℃预变性 10 的表达水平比值，来反映AKT的磷酸化水平。
min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 2.10 统计学方法
个循环。以GAPDH基因为内参，采用2 －ΔΔCt 法计算目的 采用 SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料均用
基因的表达水平。PCR 引物由武汉塞维尔生物科技有 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
限公司设计合成，其具体信息见表1。 比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
表1 PCR引物序列及扩增产物长度 3 结果
基因 引物序列（5′→3′） 扩增产物长度/bp 3.1 大鼠流产率及子宫系数计算结果
JAK2 上游：TTGGGCAAGCTGAAGGAGACT 336 与正常组比较，模型组大鼠流产率显著升高（P＜
下游：GCCGCCACTGAGCAAAAAGGTAA
STAT3 上游：CCCCCGCCCCGAGAGTG 348 0.05），子宫系数显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，地
下游：CTGGCCAGGGAAGGGAGAGC 屈孕酮组和清热安胎方组大鼠流产率均显著降低（P＜
SOCS3 上游：GGGGCCCCTTCCTTTTCTTTACCA 312
下游：GGCCCCCTCTGACCCTTTCTTTG 0.05），子宫系数均显著升高（P＜0.05）。结果见表2。
VEGFR2 上游：GCGGGCCAGGGACGGAGAAG 350 表2 各组大鼠流产率、子宫系数比较（x±s，n＝10）
下游：CCCTGGGAATGGTGAGTGTTTTG
组别 流产率/% 子宫系数/×10 －3
PI3K 上游：TACCCCCGGGAAGCTACCATTT 367 正常组 5.31±0.28 47.88±9.66
下游：CAAGACAGCCCCACCAGAGAC 模型组 22.11±3.58 a 29.53±2.60 a
AKT 上游：AATGGGGGCGAGCTCTTCTTCC 350 地屈孕酮组 6.54±0.45 b 52.65±7.00 b
下游：AGGCGGCCGCACATCATCTC 清热安胎方组 6.79±0.51 b 47.87±9.01 b
eNOS 上游：CAGCGCCCACCCAGGAGAG 311
下游：ATCGGCAGCCAAACACCAAAGTC a：与正常组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05。
GAPDH 上游：CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG 138 3.2 大鼠妊娠子宫病理学形态观察结果
下游：GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT
正常组大鼠妊娠子宫内膜组织无损伤，蜕膜细胞排
2.8 大鼠妊娠子宫中 JAK2/STAT3 通路相关蛋白表达 列整齐、紧密；模型组大鼠蜕膜细胞数量减少，子宫内膜
检测 组织出现损伤，宫内可见大量瘀血；地屈孕酮组和清热
采用免疫组化法检测。取“2.4”项下剩余切片，经二 安胎方组大鼠子宫内膜组织损伤及充血程度明显改善。
甲苯脱蜡、水化后，用柠檬酸盐缓冲液热修复 8 min，待 结果见图1。
温度降至室温后依次用H2O2孵育10 min、山羊血清孵育
30 min，然后滴加 p-JAK2、p-STAT3、SOCS3 抗体（稀释
度分别为 1∶500、1∶1 000、1∶500），于 4 ℃孵育过夜。次
日将切片复温至 37 ℃后滴加二抗孵育 20 min，以磷酸
盐缓冲液清洗后，以DAB显色10 min；经自来水冲洗后，
以苏木素复染 3 min，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中
A.正常组 B.模型组
性树脂封片后，采用显微镜进行观察。切片在 400 倍镜
下随机选取1个视野，以棕黄色为阳性染色，采用Image-
Pro Plus 6.0 软件分析视野中阳性染色的积分光密度
（integrated optical density，IOD）值。
2.9 大鼠妊娠子宫中PI3K/AKT通路相关蛋白表达检测
取“2.2”项下冻存的妊娠子宫 100 mg，加入裂解液
C.地屈孕酮组 D.清热安胎方组
裂解后，采用BCA法测定蛋白浓度；再向蛋白样品中加 注：黑色箭头所指为子宫内膜组织损伤；蓝色箭头所指为瘀血
入上样缓冲液，于沸水浴中加热15 min完成蛋白变性处 部位。
图1 大鼠妊娠子宫的病理学形态显微图（HE染色）
理。取变性后蛋白适量，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯
酰胺凝胶电泳进行分离，经转膜、封闭后，加入VEGFR2、 3.3 大鼠血清中T3、T4、TSH水平测定结果
PI3K、AKT、p-AKT、eNOS 抗体（稀释度均为 1∶1 000）， 与正常组比较，模型组大鼠血清中 T3、T4、TSH 水
于4 ℃孵育过夜；经TBST漂洗后，加入相应二抗于室温 平均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，地屈孕酮组和
孵育30 min。采用ECL试剂盒显影处理后，采用凝胶成 清热安胎方组大鼠血清中T3、T4、TSH水平均显著降低
像系统成像，再使用 Image J 软件测定条带灰度值，以 （P＜0.05）。结果见表3。

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