Page 75 - 《中国药房》2026年8期
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2.3 细胞分组、造模与给药                                     一抗（稀释比例均为1∶1 000）在4 ℃下培养过夜；次日，
              取C28/I2细胞，分为正常对照组、模型组、TFRD组、                   加入相应二抗（稀释比例为1∶5 000），室温下孵育1.5 h；
          TFRD+si-NC 组和 TFRD+si-Prdx1 组，每组设 6 个复孔。           对蛋白条带进行显影后，通过 Image J 软件分析目的蛋
          正常对照组细胞加入完全培养基；模型组细胞加入含 5                          白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值，评价目的蛋白的
          μg/mL LPS的培养基；TFRD组细胞先加入含200 μg/mL                 表达水平。
          TFRD（根据“2.2”项下结果确定）预处理 2 h，再加入 5                   2.8 统计学分析
          μg/mL LPS处理；TFRD+si-NC组细胞转染si-NC 24 h后                 采用 GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行统计分
          用 200 μg/mL TFRD 预处理 2 h，再加入 5 μg/mL LPS 处         析。数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分
          理；TFRD+si-Prdx1 组细胞转染 si-Prdx1 24 h 后用 200         析 ，进 一 步 两 两 比 较 采 用 SNK-q 检 验 。 检 验 水 准
                                                             α＝0.05。
          μg/mL TFRD 预处理 2 h，再加入 5 μg/mL LPS 处理。细
          胞转染采用Lipofectimine 3000转染试剂，转染时融合度                 3 结果
                                                             3.1 不同浓度TFRD对C28/I2细胞活性的影响
          为60%左右，所有细胞均培养总计48 h。
                                                                 如表 1 所示，在 LPS 未处理的条件下，与 0 μg/mL
          2.4 细胞凋亡检测
                                                             TFRD比较，200、400 μg/mL TFRD可显著提升C28/I2细
          2.4.1 Annexin FITC/PI法
                                                             胞活性（P＜0.05）。在 LPS 处理的条件下，与 0 μg/mL
              取 C28/I2 细胞，按照“2.3”项下方法处理后，再按照
                                                             TFRD比较，50～800 μg/mL TFRD均能显著提升C28/I2
          Annexin FITC/PI试剂盒说明书操作，使用流式细胞仪检
                                                             细胞活性（P＜0.05），其中 200 μg/mL TFRD 的促进效果
          测荧光信号，使用FlowJo软件分析细胞凋亡率。
                                                             最强。因此，以200 μg/mL作为后续TFRD的干预浓度。
          2.4.2 AO/EB双染法
                                                             表1 不同浓度 TFRD 对 LPS 处理与未处理 C28/I2 细
              取 C28/I2 细胞，按照“2.3”项下方法处理后，再按照
                                                                  胞活性的影响（x±s，n＝6）
          AO/EB双染试剂盒说明书操作，使用荧光显微镜观察并
                                                              TFRD/（μg/mL）        LPS未处理            LPS处理
          拍照，并计算凋亡细胞占比：凋亡细胞占比＝凋亡细胞                             0                  0.70±0.08        0.38±0.04
         （橘红色荧光）占总细胞（绿色荧光）比例。                                 50                  0.73±0.05        0.51±0.05 a
                                                              100                 0.79±0.07        0.75±0.06 a
          2.5 细胞自噬体检测                                         200                 0.85±0.08 a      0.89±0.06 a
              取 C28/I2 细胞，按照“2.3”项下方法处理后，再按照                  400                 0.98±0.05 a      0.66±0.05 a
                                                              800                 0.76±0.06        0.49±0.04 a
          MDC 染色试剂盒说明书操作，使用荧光显微镜观察并
                                                                a：与0 μg/mL TFRD比较，P＜0.05。
          拍照，使用Image J软件分析自噬体的MDC荧光强度。
                                                             3.2 TFRD 对 LPS 处理后 C28/I2 细胞凋亡及其相关蛋
          2.6 细胞软骨基质代谢相关因子水平检测                               白表达的影响
              取 C28/I2 细胞，按照“2.3”项下方法处理后，再按照                     与正常对照组比较，模型组 C28/I2 细胞凋亡率、凋
          ELISA 试 剂 盒 说 明 书 操 作 ，检 测 细 胞 中 MMP-13、           亡细胞占比和 PARP1 蛋白表达水平均显著升高，XIAP
          ADAMTS5、COMP的含量。                                   蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，
          2.7 细胞凋亡、自噬及Notch1/Hes1信号轴相关蛋白表                    TFRD 组 C28/I2 细胞凋亡率、凋亡细胞占比和 PARP1 蛋
          达检测                                                白表达水平均显著降低，XIAP 蛋白表达水平显著升高
              采用 Western blot 法进行检测。取 C28/I2 细胞，按           （P＜0.05）。与 TFRD+si-NC 组比较，TFRD+si-Prdx1 组
          照“2.3”项下方法处理后，收集细胞，提取总蛋白，经变                        C28/I2细胞凋亡率、凋亡细胞占比和PARP1蛋白表达水
          性、电泳、转膜、封闭等操作后，加入 XIAP、PARP1、                      平 均 显 著 升 高 ，XIAP 蛋 白 表 达 水 平 显 著 降 低（P＜
          Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、PINK1、Notch1、Hes1、Prdx1、β-actin   0.05）。结果见图1、图2、表2。













               A.正常对照组              B.模型组               C. TFRD组          D. TFRD+si-NC组     E. TFRD+si-Prdx1组
                                         图1 各组细胞凋亡的AO/EB双染显微图


          中国药房  2026年第37卷第8期                                                China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 8    · 1029 ·
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