Page 60 - 《中国药房》2026年3期
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序 列 为 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下 游 2.3 给药
引 物 序 列 为 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′） 造模 14 d 后，膝痹宁Ⅱ方低、高剂量组大鼠每日分
[13]
均由复百澳（苏州）生物科技有限公司协助合成。 别灌胃 4、8 g/kg 膝痹宁Ⅱ方药液，持续 28 d 。膝痹宁
膝痹宁Ⅱ方的组方药材淡附片、桂枝、制狗脊、山萸 Ⅱ方高剂量+siRNA 组大鼠每日灌胃 8 g/kg 膝痹宁Ⅱ方
肉、巴戟天、生薏苡仁、炒白芍、川牛膝、独一味、生甘草 药液，并在第1次灌胃前，对大鼠髓鞘内注射SETDB2的
均购自江苏省中医院中药房，经该院药学部张倩副主任 siRNA（0.2 mmol/L，20 μL/只），之后每 3 d 注射 1 次，持
[14]
中药师鉴定均为真品。 续28 d 。对照组和模型组大鼠灌胃并髓鞘内注射等体
1.3 实验动物 积无菌生理盐水。在开展髓鞘内注射前，本课题组通过
本研究所用动物为 SPF 级 8 周龄雄性 SD 大鼠，共 髓鞘内注射实验验证了SETDB2 siRNA的转染效率：将
62 只，体重 300～350 g，购自北京维通利华实验动物技 12只大鼠分为对照siRNA组和SETDB2 siRNA组，每组
术有限公司。购入后，大鼠均饲养于南京中医药大学实 6只，采用Western blot法检测发现，SETDB2 siRNA能有
验动物中心[动物使用许可证号：SYXK（苏）2023-0077]， 效降低大鼠 L3～L5 背根神经节（dorsal root ganglia，
动物房维持饲养温度为（25±2） ℃、相对湿度为（60± DRG）组织中SETDB2蛋白的表达水平。
5）%、12 h 明/12 h 暗交替，饲养期间大鼠自由进食和饮 2.4 大鼠冷刺激疼痛敏感性行为学检测
在造模的前 1 d（记为实验第 0 天）和实验第 14、28
水。本研究动物实验获得南京中医药大学实验动物伦
和42天，分别采用温度调节冷板测痛法和丙酮低温法对
理委员会批准（伦理批号：202409A047）。
2 方法 大鼠进行冷刺激疼痛敏感性行为学测试。（1）温度调节
冷板测痛法：将冷板温度保持在（4.0±0.5） °C，将大鼠
2.1 药液制备
放置于冷板中央的透明观察罩内后，立即启动计时器并
取膝痹宁Ⅱ方的组方药材（生薏苡仁15 g，淡附片、
持续观察，记录大鼠出现缩足或舔爪等痛觉反应的时
桂枝、制狗脊、山萸肉、巴戟天各 15 g，炒白芍、川牛膝、
间，即冷刺激缩足潜伏期。（2）丙酮低温法：将大鼠置于
独一味各10 g，生甘草5 g），加入600 mL水浸泡40 min，
金属网上，将1 mL丙酮快速喷洒在大鼠足跖面，观察并
武火煮沸后转文火煎煮20 min，立即用纱布过滤并收集
记录其30 s内出现缩足或舔爪等阳性反应的次数，即丙
滤液。将药渣重新置于容器中，再次加入 600 mL 水进
酮低温实验阳性次数。每组大鼠的上述指标均重复测
行二次煎煮（10 min），然后用纱布过滤并收集滤液。将
量3次，每次间隔15 min。
2 次滤液合并，用旋蒸仪浓缩成含生药量为 0.684 g/mL 2.5 样本取材与处理
[11]
的药液，于4 ℃环境下保存备用 。
行为学检测结束后，全部大鼠禁食、禁水12 h，随后
2.2 分组与造模
经腹主动脉收集大鼠外周血液。将血液在4 ℃下以3 000
将50只大鼠适应性饲养14 d后随机分为对照组、模
r/min 离心 15 min，分离血清并将其置于－80 ℃环境中
型组、膝痹宁Ⅱ方低剂量组、膝痹宁Ⅱ方高剂量组和膝
保存备用。取血后处死大鼠，提取每只大鼠双侧膝关节
痹宁Ⅱ方高剂量+siRNA组，每组10只。除对照组外，其
软骨组织，置于 4% 多聚甲醛中固定，备用。此外，提取
余各组大鼠均采取前交叉韧带横断术联合人工气候箱
大鼠L3～L5 DRG组织，将每组5只大鼠的DRG组织置
构建寒湿痹阻型KOA模型：以2 mL/kg的剂量腹腔注射 于 4% 多聚甲醛中固定，将每组其余 5 只大鼠的 DRG 组
戊巴比妥钠溶液（30 g/L）将大鼠麻醉，于膝关节处常规 织置于－80 ℃环境中保存备用。
备皮消毒，用手术刀片切开皮肤和皮下组织并切断前交 2.6 大鼠膝关节软骨组织病理形态学观察
叉韧带，通过前抽屉试验判断大鼠 KOA 模型构建成功 采用HE染色法和番红-固绿染色法观察。取经4%
[12]
后 ，将皮肤逐层缝合。对照组大鼠仅备皮后切开膝关 多聚甲醛固定的大鼠膝关节软骨组织，常规制备石蜡切
节处皮肤及皮下组织，暴露关节腔后缝合。术后每只大 片（厚 3 μm）。按照试剂盒使用说明书操作，对切片进
鼠每天肌内注射青霉素钠溶液1次，连续3 d，预防感染。 行HE染色和番红-固绿染色，使用中性树胶封片后置于
3 d后，将大鼠置于相对湿度为60%、温度为4 ℃、风速为 显微镜下观察，分别根据 Mankin 评分 和国际骨关节
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6 m/s 的人工气候箱中持续干预 14 d，每日 1 次，每次持 炎研究学会（Osteoarthritis Research Society International，
续2 h，以构建大鼠寒湿痹阻型KOA模型。大鼠寒湿痹 OARSI）评分 ，评估大鼠OA的病变程度。
[16]
阻型KOA造模成功的标准如下：（1）造模后大鼠的步态 2.7 大鼠血清中炎症因子和疼痛介质含量检测
较对照组大鼠发生改变；（2）造模后大鼠膝关节直径较 采用 ELISA 法检测。取“2.5”项下冻存的大鼠血
对照组大鼠增加；（3）造模后大鼠出现寒湿痹阻证的临 清，按照 ELISA 试剂盒说明书操作，采用酶标仪于 450
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床表现，包括活动减少、关节屈伸不利等 。本研究中 nm 波长下测定各孔的光密度值，并计算各组大鼠血清
实施寒湿痹阻型 KOA 造模的 40 只大鼠均造模成功，且 中炎症因子（TNF-α、IL-1β）与疼痛介质（NGF、CGRP）
后续实验过程中无动物脱落和死亡。 含量。
· 326 · China Pharmacy 2026 Vol. 37 No. 3 中国药房 2026年第37卷第3期
