Page 61 - 《中国药房》2026年3期
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2.8  大 鼠 DRG 组 织 中 SETDB2、H3K9me3、NGF、             TBST缓冲液洗膜3次（每次10 min）后，于室温下用辣根
          CGRP表达检测                                           过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗（稀释比例为 1∶
              采用免疫荧光法检测。取“2.5”项下经 4% 多聚甲                     5 000）孵育1 h。在凝胶成像发光系统中曝光经ECL发
          醛固定的大鼠 DRG 组织，经 0.1% Triton X-100 透化 10            光液孵育后的蛋白条带并拍照。采用Image J软件分析
          min，然后用 5% 牛血清白蛋白封闭 30 min，之后分别滴                   条带灰度值，以目的蛋白与内参（β-actin）蛋白条带灰度
          加SETDB2、H3K9me3、NGF、CGRP一抗（稀释比例均为                  值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。
          1∶100），于4 ℃下孵育过夜后，再在室温下孵育二抗（稀                      2.11 统计学方法
          释比例为1∶2 000）。使用DAPI复染细胞核，封片，于显                         使用 GraphPad Prism 9 软件进行统计分析与绘图。
          微镜下观察（染色后细胞核呈蓝色，SETDB2、NGF 阳性                      计量资料符合正态分布的以x±s表示，多组间比较采用
          染色细胞呈绿色，H3K9me3、CGRP 阳性染色细胞呈红                      单因素方差分析，组间两两比较采用 Tukey 检验。检验
          色），并利用 Image J 软件对细胞荧光强度进行定量                       水准α＝0.05。
          分析。                                                3 结果
          2.9 大鼠 DRG 组织中炎症因子和疼痛介质的 mRNA                      3.1 大鼠冷刺激疼痛敏感性行为学检测结果
          表达检测                                                   实验第 0 天，各组大鼠的冷刺激缩足潜伏期与丙酮
              采用 RT-PCR 法检测。取“2.5”项下冻存的大鼠                    低温实验阳性次数差异均无统计学意义（P＞0.05）。与
          DRG组织，采用TRIzol法提取组织中的总RNA，检测其                      对照组比较，模型组大鼠从实验第14天起冷刺激缩足潜
          浓度和纯度后，将 RNA 逆转录为 cDNA，并以 cDNA 为                   伏期显著缩短（P＜0.05），丙酮低温实验阳性次数显著
          模板进行PCR扩增。反应体系（总体积为20 μL）包含：                       增加（P＜0.05）；与模型组比较，膝痹宁Ⅱ方低、高剂量
          上 、下 游 引 物 各 0.4  μL，cDNA 模 板 2  μL，2×SYBR         组大鼠从实验第 28 天起冷刺激缩足潜伏期均显著延长
          qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7.2 μL。反应程序包          （P＜0.05），丙酮低温实验阳性次数均显著减少（P＜
          括：预变性阶段（95 ℃、30 s）、循环反应阶段（95 ℃、10                  0.05），且膝痹宁Ⅱ方高剂量组大鼠的上述指标变化较膝
          s，60 ℃、30 s，共 40 个循环）和熔解曲线阶段（95 ℃、15               痹宁Ⅱ方低剂量组显著（P＜0.05）；与膝痹宁Ⅱ方高剂
          s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s）。以β-actin为内参，采用2      －ΔΔCt  量组比较，膝痹宁Ⅱ方高剂量+siRNA 组大鼠从实验第
          法计算各目的基因 mRNA 的表达水平。各基因的特异                         28 天起冷刺激缩足潜伏期显著缩短（P＜0.05），丙酮低
          性引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列及                           温实验阳性次数显著增加（P＜0.05）。结果见表2、表3。
          扩增产物长度见表1。                                         表2 各组大鼠冷刺激缩足潜伏期比较（x±s，n＝10，s）
                    表1 引物序列及扩增产物长度                            组别               第0天    第14天     第28天    第42天
                                                              对照组            124.61±5.70  121.71±5.01  122.27±6.95  122.51±6.39
          基因名称                            引物序列（5′→3′）  扩增产物长度/bp  模型组        122.99±6.29  24.93±3.58 a  25.16±5.20 a  26.72±4.98 a
          TNF-α      上游引物：GGAGGGAGAACAGCAACTCC       93       膝痹宁Ⅱ方低剂量组      121.18±6.65  28.75±5.00  57.40±5.49 b  71.03±5.01 b
                     下游引物：GCCAGTGTATGAGAGGGACG                膝痹宁Ⅱ方高剂量组      121.36±4.66  28.43±4.70  66.97±6.75 bc  91.92±5.83 bc
          IL-1β      上游引物：CCTATGTCTTGCCCGTGGAG     118        膝痹宁Ⅱ方高剂量+siRNA组  123.75±4.55  28.16±5.26  57.44±5.37 d  73.55±5.61 d
                     下游引物：CACACACTAGCAGGTCGTCA
          NGF        上游引物：CAGCGTTTTTGATCGGCGTA     158          a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与膝痹宁
                                                             Ⅱ方低剂量组比较，P＜0.05；d：与膝痹宁Ⅱ方高剂量组比较，P＜0.05。
                     下游引物：ACGGGCAGCTATTGGTTCAG
          CGRP       上游引物：TCTCCCCTTTCCTGGTTGTC     132       表3 各组大鼠丙酮低温实验阳性次数比较（x±s，n＝
                     下游引物：CCAGTAGGCGAGCTTCTTCTT                   10，次）
          β-actin    上游引物：CGCGAGTACAACCTTCTTGC     211        组别                第0天    第14天    第28天    第42天
                     下游引物：CCTTCTGACCCATACCCACC
                                                              对照组              1.70±0.82  1.70±0.67  1.60±0.70  1.90±0.32
          2.10 大鼠 DRG 组织中 SETDB2/H3K9me3 信号轴及                 模型组              1.90±0.57  7.10±0.88 a  6.80±1.03 a  7.10±1.10 a
          炎症因子和疼痛介质相关蛋白表达检测                                   膝痹宁Ⅱ方低剂量组        1.70±0.67  7.00±0.94  5.10±0.99 b  3.60±0.84 b
                                                              膝痹宁Ⅱ方高剂量组        1.80±0.42  7.10±0.88  3.90±1.10 bc  1.90±0.74 bc
              采用Western blot法检测。取“2.5”项下冻存的大鼠                 膝痹宁Ⅱ方高剂量+siRNA组  1.70±0.48  7.20±0.92  5.70±0.82 d  4.50±1.08 d
          DRG组织，使用RIPA裂解液提取组织中的总蛋白，使用                           a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与膝痹宁
          BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度后，于100 °C下煮沸                       Ⅱ方低剂量组比较，P＜0.05；d：与膝痹宁Ⅱ方高剂量组比较，P＜0.05。
          变性。取等量蛋白上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰                           3.2 大鼠膝关节软组织病理形态学观察结果
          胺凝胶电泳分离（电压160 V，电泳时间40 min），然后电                    3.2.1 HE染色结果
          转（电压 25 V，转膜时间 30 min）至聚偏二氟乙烯膜，用                       对照组大鼠软骨表面光滑平整、结构清晰，软骨细
          无蛋白快速封闭液封闭 1 h；于 4 ℃下将膜与 SETDB2、                   胞形态正常、分布均匀且排列有序，无血管侵蚀、软骨裂
          H3K9me3、TNF-α、IL-1β、NGF、CGRP（稀释比例均为1∶              隙或炎症细胞浸润现象；与对照组比较，模型组大鼠软
          1 000）及 β-actin（稀释比例为 1∶10 000）一抗孵育过夜；             骨表面出现磨损、裂纹以及结构层次紊乱等变化，


          中国药房  2026年第37卷第3期                                                 China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 3    · 327 ·
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