Page 51 - 《中国药房》2026年1期
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组细胞形成多个悬浮克隆球后终止实验。显微镜下观                            4%多聚甲醛固定的肿瘤组织，常规制备石蜡切片（厚度
          察并记录各组细胞的成球数。通过极限稀释在线分析                            4 μm）后，行常规HE染色。通过显微镜观察肿瘤组织病
          程序（https：//bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）进行数据  理变化并拍照。
                                 [14]
          处理，计算干细胞成球概率 。                                     2.2.4 Lipo-MIT 对裸鼠肿瘤组织中 EMT 标志物、干性
          2.1.5 Lipo-MIT 对细胞中 EMT 标志物、干性标志物及                 标志物及PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响
          PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响                                    取“2.2.2”项下冻存的裸鼠肿瘤组织（每组取 3 个样
              采用Western blot法检测。A2780细胞的培养、分组                本），常规解冻后，采用 Western blot 法检测肿瘤组织中
          和药物浓度设置均同“2.1.3（1）”项下。培养 48 h 后，采                  EMT 标 志 物（N-cadherin、E-cadherin）、干 性 标 志 物
          用高效 RIPA 裂解液提取细胞中总蛋白，然后按照 BCA                     （CD133、ALDH1A1）及PI3K/AKT通路相关蛋白（PI3K、
          试剂盒方法测定上清液中总蛋白浓度。将蛋白高温变                            p-PI3K、AKT、p-AKT）的表达，其中 CD133 一抗的稀释
          性后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压                          比例为1∶1 000，其余条件均同“2.1.5”项下。
          220 V，电泳时间90 min）分离蛋白样品，并将其转移（电                    2.3 统计学方法
          流300 mA，转膜时间100 min）至聚偏二氟乙烯膜，用5%                       采用 GraphPad Prism 8 和 SPSS 25.0 软件进行作图
          脱 脂 奶 粉 封 闭 1  h。 将 膜 分 别 与 EMT 标 志 物（N-           和数据的统计分析。符合正态分布的计量资料以 x±s
          cadherin、E-cadherin）、CSCs 干 性 标 志 物（ALDH1A1、       表示。采用Levene检验验证方差齐性；若检验结果显示
          SOX2）、PI3K/AKT通路相关蛋白（p-PI3K、PI3K、p-AKT、            方差齐，采用单因素方差分析结合 LSD-t 检验进行组间
          AKT）、内参蛋白（β-actin）一抗（稀释比例均为 1∶1 000）               比较；若方差不齐，则改用 Kruskal-Wallis H 检验联合
          和驴抗兔免疫球蛋白G二抗孵育（稀释比例为1∶5 000），                      Dunnett’s t法分析。同组间实验前后各指标的比较采用
          随后对膜进行扫描，采用 Image J 软件对蛋白条带进行                      配对t检验。检验水准α＝0.05。
          灰度分析。以 N-cadherin、E-cadherin、ALDH1A1、SOX2          3 结果
          蛋白与 β-actin 蛋白条带灰度值的比值表示上述蛋白的                      3.1 细胞实验结果
          表达水平，以p-PI3K与PI3K、p-AKT与AKT蛋白条带的                   3.1.1 Lipo-MIT抑制卵巢癌细胞增殖活性
          灰度值比值表示 PI3K、AKT 蛋白的磷酸化水平。实验                           Lipo-MIT 对 3 种卵巢癌细胞的增殖均具有良好的
          重复3次。                                              抑制活性，且其对 A2780 细胞的增殖抑制效果（IC50＝
          2.2 动物实验                                           0.72 μmol/L）明显优于SK-OV3细胞（IC50＝5.41 μmol/L）
          2.2.1 造模、分组与给药                                     和OV-CAR5细胞（IC50＝2.77 μmol/L）。因此，本研究选
              将A2780细胞按5×10 个/mL皮下注射至裸鼠右侧                    取A2780细胞进行后续实验。
                                 7
          腋窝处构建异种移植瘤模型，每只裸鼠注射100 μL细胞                        3.1.2 Lipo-MIT抑制卵巢癌细胞克隆形成
          悬液。接种完成后，每天观察裸鼠生存状态是否良好，                               与对照组[克隆形成率为（31.65±3.04）%]比较，
          并观察裸鼠接种部位是否有结节生成。接种 7 d 后，裸                        Lipo-MIT 0.5、1.0、2.0、20 nmol/L 组细胞的克隆形成率
                               3
          鼠肿瘤体积约为 100 mm ，表示建模成功 。模型建立                       [ 分 别 为（21.70±2.83）% 、（18.95±4.45）% 、（9.90±
                                             [15]
          成功后，将 18 只裸鼠按照随机数字表法分为模型组和                         1.41）%、（0.60±0.14）%]均显著降低（P＜0.05），但 Lipo-
          Lipo-MIT 低、高剂量组，每组 6 只。每 2 d 监测 1 次裸鼠              MIT 0.1 nmol/L组细胞的克隆形成率[（29.9±2.83）%]差
                                           2
          的肿瘤体积[肿瘤体积＝（长径×短径 ）/2]、饮食量、饮                       异无统计学意义（P＞0.05）。
          水量、体重。Lipo-MIT 使用 5% 葡萄糖注射液稀释后采                    3.1.3 Lipo-MIT抑制卵巢癌细胞迁移
          用尾静脉注射方式给药。根据人和动物体表面积折算                                与对照组比较，Lipo-MIT 0.5、1.0、2.5 μmol/L 组细
          的裸鼠的等效剂量为 5 mg/kg，据此确定本研究中 Lipo-                   胞的迁移距离（药物作用 12、24、48 h 时）均显著缩短
          MIT 低、高剂量组的给药剂量分别为 2、5 mg/kg（单次                   （P＜0.05）；迁移细胞数均显著减少（P＜0.05）；细胞中E-
          给药）。                                               cadherin 蛋白的表达水平均显著升高（P＜0.05），而 N-
          2.2.2 动物取材、处理及脏器指数测定                               cadherin 蛋白的表达水平均显著降低（P＜0.05）。结果
              给药 12 d 后，采用颈椎脱臼法处死裸鼠。解剖裸                      见表 1（相应图片结果请扫描本文首页二维码，进入“增
          鼠，取出瘤块及心、肝、脾、肺和肾，置于生理盐水中冲                          强出版”板块查看附图1）。
          洗，吸干表面液体后对肿瘤组织及器官进行称重，并计                           3.1.4 Lipo-MIT抑制CSCs干性特征
          算脏器指数[脏器指数（%）＝器官质量/裸鼠体重×                               与对照组比较，Lipo-MIT 0.5、1.0、2.5 μmol/L 组肿
          100%]。将一部分组织置于4%多聚甲醛中固定，将另一                        瘤球形成率、细胞中 ALDH1A1 蛋白表达水平均显著降
          部分组织放入－80℃冰箱中保存。                                   低（P＜0.05）；Lipo-MIT 1.0、2.5 μmol/L组干细胞成球概

          2.2.3 Lipo-MIT对裸鼠肿瘤组织病理形态学的影响                      率、细胞中 SOX2 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。
              采用苏木精-伊红（HE）染色法观察。取“2.2.2”项下                   结果见图1、表2。


          中国药房  2026年第37卷第1期                                                  China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 1    · 45 ·
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