Page 50 - 《中国药房》2026年1期
P. 50

1.4 动物                                              2.1.3 Lipo-MIT对细胞迁移的影响
              本研究所用动物为健康 SPF 级 4 周龄雌性 BALB/c                     （1）划痕实验：将 A2780 细胞的密度调整为 3×10               5
          裸鼠，体重 15～17 g，购自北京维通利华实验动物技术                        个/mL后，均匀接种于6孔板中。常规培养24 h，待细胞
          有限公司[动物生产许可证号为 SCXK（京）2021-0006]。                   完全贴壁后，在细胞表面进行划痕。划痕完成后，将细
          动物购入后，于天津科技大学动物实验中心饲养，动物                            胞分为对照组和 0.1、0.5、1.0、2.5 μmol/L Lipo-MIT 组
          房内 12 h 光/12 h 暗交替、相对湿度为 40%～60%、温度                （浓度根据前期预实验结果设置），每组设置 3 个复孔。
          为 20～25 ℃，饲养期间裸鼠自由摄食和饮水。动物的                         以加药完成时为0 h，记录划痕宽度，随后分别在药物处
          使用与操作均符合天津科技大学生物工程学院学术委                             理12、24、48 h时拍照，记录划痕宽度并计算细胞迁移距
          员会对实验动物福利伦理的要求，伦理批件号为SWXY-                          离。细胞迁移距离＝0 h细胞划痕宽度－药物处理不同
          20241019105。                                        时间（12、24、48 h）的细胞划痕宽度。实验重复3次。
          2 方法                                                   （2）Transwell 小室实验：用无血清培养基将 A2780
                                                                                    5
          2.1 细胞实验                                            细胞的密度调整为 1×10 个/mL 后，将其均匀接种于
          2.1.1 细胞培养                                          Transwell小室的上室，每个上室加入200 μL细胞悬液。
              取 SK-OV3、OV-CAR5、A2780 细胞，接种于专用培                在Transwell小室的下室中加入600 μL含有20%胎牛血
          养基中，于 37 ℃、5%CO2条件（下同）下培养。每 2 d 更                   清的培养基，以此诱导细胞的纵向迁移。待细胞完全贴
          换1次培养基，取对数生长期细胞进行后续实验。                              壁后，按“2.1.3（1）”项下方法进行细胞分组、给药。向每
          2.1.2 Lipo-MIT对细胞增殖能力的影响                            个小室中加入4 μL溶剂/药液，48 h后，吸除上、下2个小
             （1）MTT 实验：将 3 种细胞的密度调整为 5×10                4    室中的培养基，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，分别向
          个/mL 后，分别均匀接种于 96 孔板中。常规培养 24 h，                    上、下2个小室中加入0.1%结晶紫染色20 min。擦除小
          待细胞完全贴壁后，将3种细胞分别分为空白组（不加细                           室上层细胞并将小室边缘擦净，确保只保留迁移到下室
          胞与药物）、对照组（0.1% 二甲基亚砜）和 Lipo-MIT                     膜表面的细胞。晾干后对小室进行拍照并对迁移到下
          38.65、3.865、0.386 5、0.038 65 μmol/L组（浓度根据前期         室膜表面的细胞进行计数。实验重复3次。
          预实验结果设置），每组设置 3 个复孔。按 0.5 μL/孔向                     2.1.4 Lipo-MIT对CSCs干性的影响
          对照组、给药组细胞中加入相应溶剂或者药液，处理 48                             （1）干细胞球体形成实验：将 A2780 细胞的密度调
                                                                       5
          h 后，在避光条件下向各孔中加入 MTT 溶液，放入培养                        整为 1×10 个/mL 后，将其接种于 6 孔板中。常规培养
          箱中继续培养。4 h后吸弃MTT溶液，加入100 μL二甲                       24 h，待细胞完全贴壁后，按“2.1.3（1）”项下方法进行细
          基亚砜，置于 37 ℃培养箱中孵育 10 min。采用酶标仪                      胞分组、给药。处理48 h后，吸弃培养基，用胰蛋白酶消
          在 492 nm 波长下检测各孔的光密度（optical density，               化孔板中的细胞，使用完全培养基离心，然后使用 PBS
          OD）值，并计算细胞存活率[细胞存活率（%）＝（实验组                         二次离心，弃上清液，用无血清肿瘤球形成培养基（含
          OD 值－空白组 OD 值）/（对照组 OD 值－空白组 OD                     bFGF 和 EGF）重悬细胞。对各组药物处理过的细胞进
          值）×100%]以及药物对细胞的半数抑制浓度（half                         行计数，按每孔 1 000 个细胞将其接种于超低吸附 24 孔
          maximal inhibitory concentration，IC50 ）。            板中，使每个孔中的细胞呈现单个分布（不聚团）。培养
             （2）克隆形成实验：将A2780细胞（根据“2.1.2”项下                   7～10 d，待对照组形成较多直径＞100 μm 的悬浮克隆
          实验结果确定，下同）密度调整为1 000个/mL后，均匀接                       球后终止实验。显微镜下拍照并记录各组细胞的肿瘤
          种于6孔板中。常规培养24 h，待细胞完全贴壁后，将细                         球个数，并计算肿瘤球形成率[肿瘤球形成率（%）＝每孔
          胞分为对照组（0.1% 二甲基亚砜）和 Lipo-MIT 0.1、0.5、               形成肿瘤球的个数/接种细胞总数×100%]。实验重
          1.0、2.0、20 nmol/L组（浓度根据前期预实验结果设置），                  复3次。
          每组设置 3 个复孔。按 10 μL/孔向对照组、给药组中加                         （2）极限稀释实验：将A2780细胞的密度调整为1×
                                                                5
          入相应培养基或者药液。每2 d将孔板中培养基全部吸                           10 个/mL后，将其接种于6孔板中。常规培养24 h，待细
          弃，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞2遍后，补加完全培                         胞完全贴壁后，按“2.1.3（1）”项下方法进行细胞分组、给
          养基及药物。10 d后，吸弃培养基，用PBS清洗细胞2遍                        药。处理 48 h 后，吸弃培养基，用胰蛋白酶消化孔板中
          后向每孔中加入 2 mL的 4% 多聚甲醛固定细胞，30 min                    的细胞，使用普通培养基离心后，用PBS二次离心，弃上
          后吸弃 4% 多聚甲醛，用 PBS 清洗细胞 2 遍。加入 1 mL                  清，用无血清肿瘤球形成培养基重悬细胞。对各组药物
          的 0.1% 结晶紫染色 20 min，染色结束后将结晶紫吸出，                    处理后的细胞进行计数和稀释后，将其接种于超低吸附
          用 PBS 洗净细胞，晾干拍照。按下式计算克隆形成率：                         96孔板中。每个样本按细胞数目分为4组，细胞数目呈
          克隆形成率（%）＝克隆形成数/接种细胞数×100%。实                         梯度递减（分别为 200、100、50、20 个），每组设置 3 个复
          验重复3次。                                              孔。将孔板转移到细胞培养箱中培养 7～10 d，待对照


          · 44 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 1                                中国药房  2026年第37卷第1期
   45   46   47   48   49   50   51   52   53   54   55