Page 32 - 《中国药房》2026年1期
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食。本研究动物实验已通过新疆医科大学第一附属医                             MTC）褪黑素]及 LRME 低、中、高剂量组[0.1、0.2、0.4
          院伦理委员会审批（审批号为K202407-30）。                           mg/mL（1/4、1/2、1 MTC）]。各组斑马鱼的样本量因检测
          2 方法                                                方法而异：行为学观察时每组15尾，Western blot检测时
          2.1 网络药理学预测黑果枸杞改善睡眠的作用靶点和                           每组 30 尾，ELISA 检测时每组 60 尾。采取体外水环境
          通路                                                  浸泡的方式给药，在 28 ℃培养箱中孵育，具体为：空白
          2.1.1 黑果枸杞活性成分及对应靶点的筛选                              对照组斑马鱼正常饲养24 h；模型组斑马鱼用350 μmol/L
              通过TCMSP平台（http：//tcmsp.91medicine.cn，以口         咖啡因处理 24 h；LRME 组斑马鱼在咖啡因处理同时进
          服利用度≥30%、类药性≥0.18 为筛选条件）和 Swiss-                    行药物干预24 h。
          ADME 平台（http：//www.swissadme.ch/，以胃肠道吸收             2.2.2 斑马鱼行为学观察
          得分为“high”、类药性至少通过 2 个“Yes”为筛选条件）                        药物干预结束后，应用斑马鱼行为轨迹跟踪系统分
          筛选黑果枸杞活性成分 ，并补充已有文献报道的具有                            析斑马鱼在黑暗环境中的运动时间（T）、运动距离（D）以
                              [12]
          改善睡眠作用的黑果枸杞活性成分。通过 Swiss Target                     及静息次数、静息时间和静息距离，观察时间为1 h。计
          Prediction 数据库检索活性成分靶点（probability 参数＞              算睡眠改善率和运动距离抑制比：睡眠改善率（%）＝
          0），去除重复项后得到黑果枸杞活性成分对应靶点。将                          （T 模型组－T 药物治疗组 ）/（T 模型组－T 空白对照组 ）×100%；运动距离抑
          黑果枸杞的活性成分及其对应靶点录入 Cytoscape 软                       制比＝（D 模型组－D 药物治疗组 ）/（D 模型组－D 空白对照组 ）。
          件，构建“药物-成分-靶点”网络，计算网络中各节点的度                         2.2.3 样本收集与处理
          值，以度值排前5位的活性成分作为核心成分。                                   行为学实验结束后，对斑马鱼施行安乐死。每组随
          2.1.2 黑果枸杞改善睡眠的潜在靶点筛选及其富集                           机抽取 6 尾斑马鱼用 4% 多聚甲醛固定，其余斑马鱼冻
          分析                                                  存于－80 ℃冰箱中备用。
              以“insomnia”和“sleeplessness”为检索词，分别从             2.2.4 斑马鱼脑部神经元病理学观察
          GeneCards 数 据 库（http：//www. genecards. org/，score≥      采用尼氏染色法观察。取“2.2.3”项下经4%多聚甲
          10）和 OMIM 数 据 库（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/    醛固定的斑马鱼，经冠状切片（厚5 μm）、1%尼氏染色液
          omim）收集疾病靶点。将活性成分对应靶点与疾病靶                           染色后，进行分化、二甲苯透明，再以中性树胶封片。将
          点取交集，得到黑果枸杞改善睡眠的潜在靶点。将潜在                            切片置于显微镜下拍照，并观察斑马鱼脑部神经元及尼
          靶点导入 DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov）进行         氏小体的变化。阳性染色表现为神经元细胞质内出现
          基因本体（Gene Ontology，GO）分析及京都基因和基因                    深蓝色及斑块状的尼氏物质。
          组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，      2.2.5 斑马鱼体内炎症因子、氧化应激指标和中枢神经
          KEGG）通路富集分析。以富集到的相应通路的靶点个                           递质检测
          数和－lgP 值来衡量富集程度，GO 分析中选取排前 10                           取“2.2.3”项下冻存的斑马鱼适量，进行匀浆处理，
          位的条目绘制柱状图，KEGG通路富集分析中选取排前                           将匀浆液在 4 ℃下以 3 500 r/min 离心 15 min，收集上清
          15位的通路绘制气泡图。                                        液。按 ELISA 试剂盒说明书方法操作，检测上清液中
          2.1.3 黑果枸杞改善睡眠的核心靶点筛选                               IL-6、IL-1β、IL-10、TNF-α、SOD、MDA、GSH-Px、CAT、5-
              将黑果枸杞改善睡眠的潜在靶点导入STRING数据                        HT、GABA、Glu、DA和NE水平。
          库（http：//string-db.org/），将物种限定为“Homo sapiens”、      2.2.6 斑马鱼体内核心靶点蛋白表达检测
          交互分数限定为＞0.4，绘制蛋白质-蛋白质相互作用                               取“2.2.3”项下斑马鱼适量，加入 RIPA 裂解液提取
         （protein-protein interaction，PPI）网络，并计算各靶点的          总蛋白。测定蛋白的浓度并将其高温变性，取变性后的
          度值，以度值排前5位的靶点作为核心靶点。                                蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转
          2.1.4 核心靶点和核心成分的分子对接验证                              膜、封闭后，加入一抗（AKT1、p-AKT1、EGFR、SRC、
              采用AutoDock Vina软件对筛选出的核心靶点和核                    HSP90AA1、Bcl-2、β-actin 的稀释比例分别为 1∶2 000、
          心成分进行分子对接验证。结合自由能越低，表明该核                            1∶5 000、1∶10 000、1∶10 000、1∶2 000、1∶10 000、1∶10 000），
          心成分与核心靶点的亲和力越高。                                     在4 ℃下孵育过夜；加入二抗（稀释比例为1∶10 000），在
          2.2 黑果枸杞改善睡眠的作用及机制研究                                室温下孵育 1 h；经 TBST 缓冲液洗涤后，加入 ECL 显影
          2.2.1 分组、给药与造模                                      并检测。采用 Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以各
              本课题组前期通过对咖啡因造模（即睡眠剥夺模                           目的蛋白与内参（β-actin）蛋白条带灰度值的比值表示各
          型）浓度以及斑马鱼的药物最大耐受浓度（maximum                          目的蛋白的表达水平。
          tolerated concentration，MTC）进行考察，确定咖啡因的             2.2.7 统计学方法
          造模浓度为 350 μmol/L，斑马鱼对 LRME 的 MTC 为 0.4                  采用 GraphPad Prism 10.1.2 软件绘图，采用 SPSS
          mg/mL、对褪黑素的MTC为0.8 mg/mL。在显微镜下挑                     22.0软件对数据进行统计分析。计量资料以x±s表示，
          选发育正常的斑马鱼，随机分为空白对照组、模型组                             多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用
         （350  μmol/L 咖 啡 因）、阳 性 对 照 组 [0.4  mg/mL（1/2        LSD-t检验。检验水准α＝0.05。


          · 26 ·    China Pharmacy  2026 Vol. 37  No. 1                                中国药房  2026年第37卷第1期
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