Page 36 - 《中国药房》2025年23期
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为（20～25） ℃、相对湿度为 50%～60%、昼 12 h/夜 12 h              固定保存；将左肾经肾门横切后沿冠状面剖开，分装于
          循环，饲养期间大鼠自由获取常规灭菌饲料及无菌水。                            无酶冻存管中，以液氮速冻后转至－80 ℃冰箱中保存，
          本实验由河南中医药大学实验动物伦理委员会审核并                             备用。
          批准（批准编号为 IACUC202306014），所有实验操作均                    2.3 尿液及血清中生化指标检测
          遵循动物实验“3R”原则。                                           取“2.2”项下尿液及血清，采用全自动特定蛋白仪测
          2 方法                                                定尿液中24 h-UTP，采用全自动尿液分析仪检测尿液中
          2.1 IgAN大鼠模型构建与实验分组                                 红细胞计数，采用全自动生化分析仪检测血清中血尿素
              先将 60 只大鼠适应性饲养 7 d（其间大鼠状态及随                     氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，
          机尿蛋白检测结果均正常），然后采用随机数字表法将                            Scr）、白蛋白（albumin，Alb）及丙氨酸氨基转移酶（ala‐
                                                              nine amino-transferase，ALT）水平。
          其分为空白组（n＝12）和造模组（n＝48）。造模组大鼠
                                                              2.4 肾组织病理形态学观察
          参考文献[9]方法建立 IgAN 模型：隔日灌胃牛血清白蛋
                                                                  采用 HE 染色法观察。取“2.2”项下固定后的肾组
          白溶液（100 g/L）800 mg/kg，持续12周；每周单次皮下注
                                                              织，经修剪、梯度乙醇脱水、石蜡包埋及切片（厚 4 μm）
          射四氯化碳与蓖麻油的混合液（1∶3，V/V）0.4 mL，持续
                                                              后，行常规HE染色，封片。将切片置于正置光学显微镜
          12 周；实验第 6、8、10 周分别单次尾静脉推注脂多糖溶
                                                              下，观察肾小球、肾小管及间质区域的病理变化。
          液（0.25 g/L）0.2 mL。空白组大鼠同期予以等体积蒸馏
                                                              2.5 肾小球系膜区IgA沉积检测
          水灌胃、等体积蓖麻油皮下注射及等体积 0.9% 氯化钠
                                                                  采用免疫荧光法检测。取“2.4”项下肾组织石蜡切
          溶液尾静脉注射。造模结束前 24 h，对大鼠进行限饲
                                                              片（每组3个样本），经脱蜡、复水及抗原修复后，进行封
         （自由饮水），使用代谢笼收集其 24 h 尿液，并检测其 24
                                                              闭。随后滴加IgA一抗（稀释比例为1∶10），于4 ℃下孵
          h 尿蛋白总量（24 h total urinary protein，24 h-UTP）。随
                                                              育过夜；采用磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，滴加 IgG 二抗
          后随机处死空白组及造模组大鼠各2只，取肾组织行HE
                                                             （稀释比例为1∶200），室温避光孵育50 min；采用PBS再
          染色及免疫荧光检测，方法见“2.4”“2.5”项下。结果显
                                                              次充分漂洗后，滴加自发荧光淬灭剂，以抗淬灭封片剂
          示，造模组大鼠肾组织系膜区可见明显IgA沉积，并伴系
                                                              封固。将切片置于正置荧光显微镜下观察，绿色荧光表
          膜基质增生；肾小管上皮细胞变性及局灶性坏死，间质
                                                              示阳性表达。采用Image J软件对荧光强度进行定量分
          见淋巴细胞浸润。上述结果符合 IgAN 典型病理特征，
                                                              析，计算平均光密度值，以此来定量评估 IgA 的沉积
          表明IgAN大鼠模型成功建立 。
                                   [10]
                                                              情况。
              剔除用于模型验证的4只大鼠及实验过程中死亡的
                                                              2.6 肾组织中 CXCL12、CXCR4、STAT3 mRNA 表达
          1 只大鼠（空白组）后，将剩余 55 只大鼠（空白组 9 只、造
                                                              检测
          模组46只）纳入后续实验。将造模成功的大鼠随机分为
                                                                  采用RT-qPCR法检测。取“2.2”项下－80 ℃保存的
          模型组（n＝10）、醋酸泼尼松组（阳性对照组，n＝12）和
                                                              大鼠（每组 3 只）肾组织，采用 Trizol 法提取组织中总
          肾必宁颗粒低、高剂量组（n＝12）。根据人与大鼠体表                          RNA，检测其纯度和浓度后，将RNA反转录合成cDNA，
          面积换算，最终确定大鼠的给药剂量如下：肾必宁颗粒                            并以 cDNA 为模板进行 qPCR 扩增。反应条件为：95 ℃
          低、高剂量分别为 4.17、8.33 g/（kg·d）（分别为 1、2 倍临              预变性 30 s；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火/延伸 30 s，共 40
          床等效剂量），醋酸泼尼松为 6.25 mg/（kg·d）（临床等效                   个循环。反应体系为：SYBR Green qPCR Master Mix
          剂量）。各组药物均以蒸馏水为溶剂配制。空白组和模                            7.5 μL，上、下游引物各 1.5 μL，cDNA 模板 2.0 μL，无酶
          型组大鼠灌胃蒸馏水。药液或蒸馏水的灌胃体积均为5                            水 4.0 μL。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-
          mL/kg，每日灌胃1次，连续4周。                                  phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，采用2     －ΔΔCt 法
          2.2 标本采集与处理                                         计算各目的基因的 mRNA 相对表达量。引物由武汉赛
              末次给药后，使大鼠禁食不禁水 24 h，收集其 24 h                    维尔生物科技有限公司提供。引物序列及产物扩增长
          尿液。将尿液充分混匀后取 10 mL，以 3 000 r/min 离心                 度见表1。
          15 min，收集上清液，置于－20 ℃冰箱中保存，备用。尿                      2.7 肾组织中 CXCL12、CXCR4、STAT3、p-STAT3 蛋
          液采集完毕后，将大鼠麻醉，开腹暴露其腹主动脉并穿                            白表达检测
          刺采血 5～8 mL。将血样在室温下静置 30～60 min，然                        采用 Western blot 法检测。取“2.2”项下－80 ℃保
          后在 4 ℃下以 3 000 r/min 离心 15 min，分离血清，置               存的大鼠（每组3只）肾组织，粉碎匀浆后取上清液，采用
          于－20 ℃冰箱中保存，备用。采血后夹闭大鼠腹主动                           BCA法测定组织中总蛋白浓度。将蛋白高温变性后，上
          脉，迅速剥离其双侧肾脏包膜，取出肾脏，用4 ℃生理盐                          样进行 SDS-PAGE 电泳（恒压 200 V，电泳时间 30 min）
          水冲洗。将右肾沿冠状面切开，置于通用固定液中常温                            分离，随后转膜（恒流300 mA，转膜时间30 min），封闭。


          · 2914 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 23                            中国药房  2025年第36卷第23期
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