Page 39 - 《中国药房》2025年20期
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mRNA 扩增引物由北京擎科生物科技有限公司设计并                          2.3 兔股骨微结构检测
          合成，具体信息见表1。                                            采完血后处死各组兔，分离出双侧股骨；清洗后，取
                  表1 PCR引物序列及扩增产物长度                          部分右侧股骨（剩余部分冻存，备用）放入多聚甲醛中固
          目的基因        引物序列（5′→3′）                产物长度/bp     定48 h，然后使用Micro-CT影像系统检测其股骨的骨密
          VEGF        正向：GCAGACCAAAGAAAGACAG       103       度（bone mineral density，BMD）、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp。
                      反向：TTGCAGGAACATTTACACG
          BMP2        正向：GAGAAAAGCGTCAAGCGAAAC     121       2.4 兔股骨组织的病理学形态观察
                      反向：AGTAAAAGGCGTGATACCCCG                   取各组兔左侧股骨，用10%乙二胺四乙酸进行脱钙
          β-actin     正向：TGGCTCTAACAGTC CGCCTAG    119
                      反向：AGTGCGACGTGGACATCCG                 处理，然后进行常规石蜡包埋、切片；取部分切片进行
          1.3 实验动物                                           HE 染色，再利用光学显微镜观察股骨组织的病理学形
              本研究所用动物为 3 月龄新西兰兔，共 36 只，体重                    态，并计算空骨陷窝率：空骨陷窝率＝空骨陷窝数/骨陷
          约 2.3～2.5 kg，由内蒙古大学提供，动物生产许可证号                     窝数×100%。
          为 SCXK（蒙）2020-0006。 兔 饲 养 环 境 温 度 为 20～            2.5 兔股骨组织细胞凋亡情况检测
          24 ℃，相对湿度为40%～60%，自由活动、采食。本实验                          取“2.4”项下各组兔剩余切片，经脱蜡、抗原修复后，
          经内蒙古大学生命科学学院动物伦理委员会批准（批准                           加入0.1%Triton X-100试剂进行通透处理，再以5%牛血
          文号IMU-2024-mouse-080）。                             清白蛋白封闭后，滴加 TUNEL 反应液孵育，再加入 4′，
          2 方法                                               6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液复染细胞核；封片后，
          2.1 造模与分组                                          采用荧光显微镜观察细胞凋亡情况（凋亡细胞呈绿色荧
              将兔适应性喂养7 d后，随机选取27只作为造模组，                      光），并计算细胞凋亡率：细胞凋亡率＝凋亡细胞数/总细
          按下述方法造模：于兔耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素                            胞数×100%。
         （10 μg/kg），24 h后再次注射1次；随后于臀中肌注射甲                    2.6 兔股骨组织中VEGF、BMP2 mRNA表达检测
          泼尼龙（20 mg/kg），每隔 24 h 注射 1 次，共注射 3 次；另                 取“2.3”项下各组兔冻存的右侧股骨组织，研磨成
          外，每周肌内注射青霉素钠（5 万单位/kg）2 次，预防感                      粉，取适量，加入Trizol试剂提取总RNA；将上述总RNA
            [7]
          染 。另取 9 只兔，以生理盐水代替药物，作为对照组                         反转录成 cDNA 后，以此 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。
         （Control 组）。5 周后，从造模组和 Control 组中分别选
                                                             PCR 扩增体系（20 μL）为 2×SYBR Green Mix 10 μL、
          取 3 只兔，采用 Micro-CT 影像系统检测其股骨骨小梁
                                                             正/反向引物各0.8 μL、cDNA模板2 μL、无核酸酶水6.4
          厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数（trabecular
                                                             μL。PCR 扩增程序为 95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 5 s，
          number，Tb.N）和骨小梁分离度（trabecular separation，
                                                             60 ℃退火和延伸30 s，共40个循环。以β-actin为内参，
          Tb.Sp），并通过HE染色法观察其股骨组织的病理变化。
                                                             采用2  －ΔΔCt 法计算兔股骨组织中VEGF、BMP2 mRNA 的
          当造模组兔出现骨小梁排列稀疏、骨细胞数量减少、空
                                                             表达水平（结果以Control组为参照进行归一化处理）。
          骨陷窝数增多，且 Tb.Th、Tb.N 较 Control 组兔降低，Tb.
                                                             2.7 兔股骨组织中 RIPK1/RIPK3/MLKL 信号通路相
          Sp 较 Control 组兔升高时，表明 SONFH 模型兔构建成
                                                             关蛋白表达检测
          功 。将造模成功的 24 只兔按随机数字表法分为模型
            [8]
                                                                 取“2.6”项下各组兔右侧股骨组织粉末，加入 RIPA
          组（Model组）、PACs低剂量组（PACs-L组）、PACs高剂量
                                                             裂解液充分裂解，离心后取上清蛋白；将蛋白变性处理
          组（PACs-H 组）、PACs 高剂量+RIPK1 激活剂组（PACs-
                                                             后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转
          H+rRIPK1 组），每组 6 只。根据动物与人的等效剂量进
          行换算，PACs-L 组、PACs-H 组兔分别灌胃 11、22 mg/kg             膜，加入封闭液封闭；分别加入p-RIPK1、RIPK1、p-RIPK3、
          PACs 并尾静脉注射等体积生理盐水，每天 1 次；PACs-                    RIPK3、p-MLKL、MLKL、caspase-8、GAPDH 一抗（稀释
              [6]
          H+rRIPK1 组兔在灌胃 22 mg/kg PACs 的同时尾静脉注               比例均为 1∶1 000），于 4 ℃下孵育过夜；加入相应二抗
                         [9]
          射 4 μg/kg rRIPK1 ，每天 1 次；Control 组和 Model 组兔      （稀释比例为 1∶1 000），于室温下孵育 1 h；洗膜后，以
          灌胃并尾静脉注射等体积生理盐水，每天1次。各组兔                           ECL试剂显影，并使用凝胶成像系统成像。采用Image J
          均被持续干预4周。                                          软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白
          2.2 兔血清中TNF-α、IL-6含量检测                            （GAPDH）的条带灰度值比值表示目的蛋白的表达水
              末次给药结束后，对各组兔进行耳缘静脉采血，离                         平，以p-RIPK1与RIPK1、p-RIPK3与RIPK3、p-MLKL与
          心后取上清液，采用 ELISA 法以酶标仪检测其血清中                        MLKL的表达水平比值表示RIPK1、RIPK3、MLKL蛋白
          TNF-α、IL-6含量。                                      的磷酸化水平。


          中国药房  2025年第36卷第20期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 20    · 2521 ·
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