Page 32 - 《中国药房》2025年20期
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BC5655）购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗鼠 IgA 多                     （BQTQ-H 组）、阳 性 对 照 组（BZP 组），每 组 15 只 。
          克隆抗体（批号bs-10491R）购自北京博奥森生物技术有                       BQTQ-L组、BQTQ-H组大鼠分别灌胃补气通窍方9.81、
          限公司；异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗兔IgG二                        19.62 g/kg（以生药量计，以生理盐水为溶剂；基于“异病
          抗（批号 33107ES60）购自翌圣生物科技股份有限公司；                      同治”理论，分别以临床等效剂量及其2倍作为BQTQ-L
          FITC标记的抗大鼠CD3单克隆抗体（批号561801）购自                      组、BQTQ-H组的剂量）；BZP组大鼠灌胃盐酸贝那普利
          美国 BD 公司；别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）/cya‐            10 mg/kg（以生理盐水为溶剂，剂量参考预实验及相关文
          nine7标记的抗大鼠CD4抗体、藻红蛋白（phycoerythrin，                献 设置）；Normal 组和 Model 组大鼠灌胃等体积生理
                                                                [10]
          PE）标记的抗大鼠 CD25 抗体、Alexa Fluor  647 标记的              盐水；每天1次，连续8周。
                                               ®
          抗大鼠叉头框蛋白（forkhead box protein 3，FOXP3）抗体            2.3 样本收集
         （批号分别为 201518、202105、320014）均购自美国 Bio‐                   分别于实验第 8、10、12、14、16 周末，收集各组大鼠
          Legend 公司；PerCP-eFluor 710 标记的抗大鼠 CD8a 抗           （禁食不禁水）的 24 h 尿液，备用。末次给药后，收集各
          体、PE-cyanine7标记的抗大鼠白细胞介素17A（interleu‐               组大鼠新鲜粪便，于－80 ℃下保存，备用。上述样品采
          kin-17A，IL-17A）抗体、细胞刺激试剂盒（批号分别为46-                  集完成后，以腹腔注射2%戊巴比妥钠3 mg/kg麻醉各组
          0084-82、25-7177-80、00-4975-93）均 购 自 美 国 Thermo
                                                              大鼠，经腹主动脉采集血样，备用；取血后，将大鼠处死，
          Fisher Scientific公司。
                                                              摘取其双肾，取左侧肾脏对半切开后，置于4%多聚甲醛
          1.3 实验动物
                                                              溶液中固定，备用。
              SPF级雄性SD大鼠80只，体重180～200 g，购自湖
                                                              2.4 24 h尿蛋白含量测定
          南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号
                                                                  取“2.3”项下各组6只大鼠各时间点的24 h尿液，采
          SCXK（湘）2019-0001。所有大鼠均饲养于 SPF 级屏障
                                                              用尿蛋白试剂盒（比色法）检测 24 h 尿蛋白（24-hour
          环境（温度 25 ℃，相对湿度 50%～60%，每 12 h 光照/黑
                                                              urine total protein，24 h UTP）含量。
          暗循环）内，自由摄食、饮水。本研究方案经过广西中医
                                                              2.5 血清Scr、BUN含量测定
          药大学实验动物福利伦理委员会审核批准（批准编号
                                                                  取“2.3”项下各组 6 只大鼠的血样，于室温下静置 2
          DW20240319-060）。
                                                              h后，再于4 ℃下以3 500 r/min离心15 min，分离上层血
          2 方法
                                                              清，采用全自动生化分析仪测定各组大鼠血清 Scr 及
          2.1 药液的制备
                                                              BUN含量。
              取黄芪、党参、甘草、苍耳子、辛夷、细辛、荆芥、桔
                                                              2.6 肾组织病理观察
          梗、鱼脑石、升麻、柴胡（质量比20∶12∶12∶6∶10∶2∶15∶10∶
                                                                  取“2.3”项下各组6只大鼠经4%多聚甲醛溶液固定
          10∶3∶9），混匀，加 12 倍量水浸泡 30 min，武火煮沸后转
                                                              48 h 的肾组织，修剪至合适大小后置入组织包埋盒中，
          文火煎煮 60 min，过滤；药渣再次加 12 倍量水，同法煎
                                                              依次进行脱水、透明、浸蜡、包埋，以5 μm厚度进行连续
          煮，过滤；合并两次滤液，于50 ℃左右减压旋转蒸发，得
                                                              切片，于45 ℃温水中摊片1～2 min，待切片完全展开后
          质量浓度为 3 g/mL（以生药量计）的浓缩液，于－20 ℃
                                                              用防脱载玻片捞出，于 98 ℃下烤片 20 min 后保存，备
          下保存，备用。
                                                              用。取切片，经常规脱蜡、脱水后，依次用苏木精、1%伊
          2.2 分组、造模与给药
              取SD大鼠80只，适应性喂养1周后，随机分为空白                        红溶液染色，再以中性树胶封片，使用显微镜观察大鼠
          组（Normal组，17只）和造模组（63只）。取造模组大鼠，                     肾组织形态学改变，并拍照保存。
          按照相关文献 方法并改进，构建 IgAN 大鼠模型：灌胃                        2.7 肾小球IgA免疫复合物沉积情况检测
                      [9]
          BSA溶液（以水为溶剂）400 mg/kg，隔天1次，持续8周+                        采用免疫荧光法检测。取“2.3”项下各组 6 只大鼠
          皮下注射 CCl4和蓖麻油混合液（体积比 1∶3）0.4 mL，每                   的肾组织适量，按“2.6”项下方法制备石蜡切片。取切
          周 1 次，持续 8 周+尾静脉注射 LPS[以磷酸盐缓冲液                      片，经常规脱蜡至水后，加乙二胺四乙酸进行抗原修复，
         （PBS）为溶剂]0.05 mg，于第 6、8 周各注射 1 次。于第 8                再以 3%BSA 于 37 ℃下封闭 1 h；滴加 IgA 一抗（稀释度
          周末，随机选取5只大鼠（Normal组2只，造模组3只）以                       为 1∶1 000），于 4 ℃下避光孵育过夜（＞8 h）；以 PBS 洗
          免疫荧光法验证，若Normal组大鼠肾小球内未见或少见                         涤3次，滴加相应IgG二抗（稀释度为1∶100），于37 ℃下
          IgA 免疫复合物沉积，而造模组大鼠肾小球内存在大量                          避光孵育 2 h；以 PBS 洗涤 3 次，再以抗荧光淬灭封片液
          弥散性 IgA 免疫复合物沉积，则表明 IgAN 模型复制成                      100 μL 封片，使用荧光显微镜观察并采集图像，使用
          功（具体操作见“2.7”项）。                                     Image J软件分析各组大鼠肾小球内IgA阳性区域（呈绿
              将造模成功的大鼠随机分为模型组（Model）组、补                       色荧光）的荧光强度，用以反映 IgA 免疫复合物的沉积
          气通窍方低剂量组（BQTQ-L 组）、补气通窍方高剂量组                        情况。


          · 2514 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 20                            中国药房  2025年第36卷第20期
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