Page 35 - 《中国药房》2025年19期
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程（上海）股份有限公司设计合成；siRNA 转染试剂盒、                       4%多聚甲醛固定；浸洗后，细胞以0.5% TritonX-100（采
          Trizol试剂（批号分别为L3000015、15596026CN）均购自              用 PBS 配制）于室温下通透；浸洗后，分别滴加 SGK2、
          美 国 Invitrogen 公 司 ；FastStart  Universal  SYBR  Green   WNK1 或 SGK2、WNK4 一抗（稀释比例均为 1∶500），于
          Master（Rox）试剂盒（批号04913914001）购自瑞士Roche             4 ℃下孵育过夜；加入荧光二抗（稀释比例为 1∶1 000），
          公司；扩增所用引物由宝生物工程（大连）有限公司协助                          于37 ℃下孵育1 h；浸洗后，滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲
          合成。                                                哚（DAPI）染核，避光孵育10 min；浸洗后，在荧光显微镜
          1.3 实验细胞与动物                                        下观察并拍照。为评估 SGK2 与 WNK1 或 WNK4 的共
              人绒毛膜滋养层细胞 HTR-8/SVneo 购自上海雅吉                   定位水平，采用双重荧光免疫标记的倒置荧光显微图像
          生物科技有限公司。24 只 8～9 周龄 SPF 级雌性 CBA/J                 作为分析基础。将图像导入 Image J 软件后，应用自动
          小鼠，体重（20.2±0.6）g；10 只 9～10 周龄 SPF 级雄性              阈值算法将Merge图像转化为二值图像，以明确阳性信
          DBA/2 小鼠，体重（20.8±1.1）g；2 只 9～10 周龄 SPF 级           号区域。随机选取5个无重叠的视野进行定量分析：利
          雄性 BALB/C 小鼠，体重（22.9±1.0）g。所有小鼠均购                  用 IHC Profiler 插件对免疫荧光染色强度进行自动化评
          自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可                           分，并进一步采用 Trainable Weka Segmentation 插件对
          证号为 SCXK（京）2021-0011。小鼠在温度 20～25 ℃、                SGK2、WNK1或SGK2、WNK4双标阳性细胞进行计数。
          相对湿度40%～70%、每12 h明暗交替的环境中饲养，自                      阳性细胞占比（%）＝目的蛋白阳性细胞数/DAPI阳性细
          由饮水、摄食。本实验方案经江西省妇幼保健院伦理委                           胞数×100%，计算 SGK2 阳性细胞与 WNK1 或 WNK4
          员会批准（审批号：科研伦审IACUC 2024153）。                       阳性细胞的相对表达量表示共定位水平。
          2 方法                                               2.1.4 细胞WNK信号通路及蜕膜化相关蛋白和mRNA
          2.1 CCF对LPS诱导的HTR-8/SVneo细胞的影响                     的检测
          2.1.1 细胞造模、分组与给药                                       采用 Western blot 法检测蛋白的表达。取对数生长
              取 CCF 溶于 DMSO 中，避光保存于 4 ℃冰箱中，备                 期的细胞，按“2.1.1”项下方法造模、分组、给药。培养
          用。SGK2抑制剂GSK650394溶于DMSO中，再用水稀                     24 h后，收集细胞并消化，加入RIPA蛋白裂解液和蛋白
          释，备用。取对数生长期的 HTR-8/SVneo 细胞，以 6×                   酶抑制剂 PMSF，于 4 ℃下振摇 5 min，收集上清液。将
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          10 个/mL 的密度接种于 6 孔板，以含 10% 胎牛血清的                   上清液于 4 ℃下以 14 000 r/min 离心 5 min，取上清液以
          DMEM培养基培养。待细胞融合至80%～90%，将其随                        BCA法测定蛋白浓度后进行加热变性处理（100 ℃加热
          机分为空白组、LPS 组、CCF 组、抑制剂组（GSK 组）、                    15 min）。取变性蛋白适量，进行电泳分离，转膜，用封闭
          CCF+抑制剂组（CCF+GSK组）。除空白组外，其余各组                      液封闭 1 h；加入 β-actin、SGK2、WNK1、WNK4、PRL、
          细胞用含100 μg/L LPS和10%胎牛血清的DMEM培养                    IGFBP-1、OSR1、SPAK 一抗（稀释比例均为 1∶500），于
                                                 [15]
          基 100 μL 诱导 24 h 构建滋养层细胞炎症模型 ；随后，                  4 ℃下孵育过夜；用 PBST 清洗后，加入二抗（稀释比例
          空白组、LPS组细胞加入100 μL的1% DMSO，CCF组细                   为 1∶1 000），于室温下避光孵育 1 h；用 PBST 清洗 3 次，
          胞加入 100 μL 400 mg/L CCF（CCF 剂量根据前期预实               使用 ECL 显影液显影后成像。采用 Image J 软件分析，
          验得出，下同），GSK 组细胞加入 100 μL 10 μmol/L                 以目标蛋白与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示
                    [16]
          GSK650394 ，CCF+GSK 组细胞加入 100 μL 400 mg/L           目标蛋白的表达水平。
          CCF+100 μL 10 μmol/L GSK650394，于培养箱中培养                 采用 qRT-PCR 法检测 mRNA 的表达。取对数生长
          24 h，进行后续实验。每组设5个复孔，实验重复3次。                        期的细胞，按“2.1.1”项下方法造模、分组、给药。培养
          2.1.2 细胞增殖水平检测                                     24 h 后，收集细胞，用 TRIzol 试剂盒提取总 RNA 后，按
              采用 CCK-8 实验检测。取对数生长期的细胞，按                      照反转录试剂盒操作说明将其反转录成 cDNA；以此
         “2.1.1”项下方法造模、分组、给药。培养24 h后，每孔加                     cDNA 为模板，加入相应引物，使用 FastStart Universal
          入 10 μL 的 CCK-8 试剂，孵育 2 h 后，使用酶标仪于 450             SYBR Green Master（Rox）试剂盒，根据试剂盒中的说明
          nm波长处检测各孔的光密度（OD）值，并计算细胞存活                         书进行 PCR 扩增，具体反应体系为：FastStart Universal
          率[细胞存活率（%）＝（OD 给药组/OD 空白组 ）×100%]。                 SYBR（2×）Forward 10.0 μL，正、反向引物各0.6 μL（具
          2.1.3 细胞中SGK2与WNK1、WNK4共定位检测                       体引物序列及产物长度见表 1），cDNA 模板 2 μL，dH2O
              采用免疫荧光共定位实验检测。取对数生长期的                          6.8 μL，共 20 μL。反应条件为：预变性 95 ℃ 30 s，变性
          细胞，按“2.1.1”项下方法造模、分组、给药。培养 24 h                    95 ℃ 10 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 15 s，40 个循环，
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          后 ，收 集 细 胞 ，以 3×10 个/mL 接 种 于 6 孔 板 中 ，于           每组重复 3 次。以 GAPDH 为内参，采用 2           －ΔΔCt 法对目标
          37 ℃、5%CO2条件下培养，待细胞融合至70%～80%，用                    基因mRNA的表达水平进行相对定量分析。


          中国药房  2025年第36卷第19期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 19    · 2381 ·
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