Page 36 - 《中国药房》2025年19期

表1 qRT-PCR引物序列及产物长度 胞，按照线粒体膜电位试剂盒说明书操作，检测各组细
基因 正向引物（5′→3′） 反向引物（5′→3′） 产物长度/bp 胞单体荧光（绿色）和聚合物荧光（红色），并计算红/绿荧
SGK2 TCATCGGCAAAGGGAACT CCTCAGCAGCGTAGAACC 309 光强度比值以反映线粒体膜电位（上述比值降低表示细
WNK1 CAGAGTGAGCAGCCAACAGA CCACGGACTGAGGCATACTT 152
WNK4 CACCCAGCGAGTCCGTCTGT CCACCCTCTGTCTGTCATCCT 149 胞线粒体膜电位降低）。
PRL GGTGGGCCTTCCTAACGAG GACCACATCAGGCTCAATGCT 365 2.3 CCF对RSA小鼠的影响
IGFBP-1 TGCTCAGATCCCCTTGTGAT AGCTGGTGGGTTTGTGACAT 210 2.3.1 小鼠造模、分组与给药
OSR1 CTCCTTCCTTCAGGCAGTG ATCTCGGGCTTGGGTTG 243 [18]
SPAK GGCCCATCTGCAGGGAC CTACACGTTCTTGCCTGGGT 102 参考文献构建小鼠RSA模型 。小鼠适应性饲养1
GAPDH TCGTGGAAGGACTCATGACC TCCACCACCCTGTTGCTGTA 469 周后，20 只雌性 CBA/J 小鼠与 10 只雄性 DBA/2 小鼠按
2.2 敲低SGK2对CCF药效的影响 2∶1合笼交配构建RSA模型，4只雌性CBA/J小鼠与2只
2.2.1 细胞分组、siRNA转染与给药 雄性 BALB/C 小鼠按 2∶1 合笼交配构建正常妊娠模型。
取对数生长期的细胞，分为空白组、LPS组、siSGK2 于合笼次日早晨对雌鼠进行阴道涂片，若可见大量精子
组、siSGK2+CCF 组。空白组、LPS 组使用正常的 HTR- 或阴道栓，记为妊娠第1天。从妊娠第1天开始，将20只
8/SVneo 细胞，按“2.1.1”项下方法干预。siSGK2 组、 RSA模型CBA/J小鼠随机分为5组：模型组（生理盐水灌
siSGK2+CCF 组使用转染后的 HTR-8/SVneo 细胞，具体 胃）、CCF低剂量组（20 mg/kg CCF灌胃）、CCF高剂量组
转染、干预过程如下：根据 siRNA 转染试剂说明书进行 （40 mg/kg CCF 灌胃）、GSK 组（10 mg/kg GSK650394 腹
转染体系的配制及转染操作，将携带空白质粒和携带 腔注射）、联合给药组（40 mg/kg CCF 灌胃+10 mg/kg
siRNA SGK2质粒的逆转录病毒分别感染HTR-8/SVneo GSK650394 腹腔注射），每组 4 只；将 4 只正常妊娠模型
细胞，得到阴性对照细胞和敲低 SGK2 的 HTR-8/SVneo 小鼠作为对照组（生理盐水灌胃）。所有小鼠每天干预1
细胞。转染体系为 46 μL GA-RNA 缓冲液、4 μL 20 次 ，持 续 14 d。 CCF 的 剂 量 设 置 参 考 文 献 [19]，
μmol/L siRNA 和 7.5 μL GA-RNA 试剂。将配制好的转
GSK650394的剂量设置参考文献[20]。
染体系室温放置 20 min，随后加入培养液中，24 h 后换
2.3.2 小鼠胚胎着床数、活胎数及丢失胚胎数的计算
液。阴性对照的正向引物为 5′-UUCUCCGAACGAG-
末次给药结束后，处死各组小鼠并剖宫，记录并计
UCACGUTT-3′，反向引物为 5′-ACGUGACUCGUUC-
算其胚胎着床数、活胎数及丢失胚胎数。胚胎着床数计
GGAGAATT-3′；siSGK2 的正向引物为 5′-TAGGTGC-
算方法参考文献[21]。活胎判断标准为：胎鼠体形完整，
TCGACTATGTCAACGG-3′，反向引物为 5′-AAACCC- [22]
颜色发红或粉红，有自然动作，胎盘大，色红 。丢失胚
GTTGACATAGTCGAGCA-3′。参考“2.1.4”项下 qRT-
胎判断标准为：胚胎体积明显缩小，或失去正常胚胎形
PCR法检测转染前后细胞内SGK2 mRNA的表达水平，
[23]
状，胎盘颜色暗红，母胎界面有出血水肿 。
若转染后SGK2 mRNA的表达水平显著低于转染前，表
2.3.3 小鼠子宫内膜结构及蜕膜化情况观察
[17]
明 SGK2 成功敲低 。取转染后的 HTR-8/SVneo 细胞，
采用HE染色法观察。分离各组小鼠的右侧子宫内
5
以 6×10 个/mL 的密度接种于 6 孔板中，以含 100 μg/L
膜组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h，经二甲苯透明后
LPS 的 DMEM 完全培养基 100 μL 培养 24 h 后，siSGK2
进行石蜡包埋、切片。取切片，经脱蜡、梯度乙醇水合
组细胞加入 100 μL 的 1% DMSO，siSGK2+CCF 组细胞
后，以苏木精染色10 min；经水冲洗、盐酸乙醇处理30 s、
加入 100 μL 的 1% DMSO+100 μL 的 CCF（400 mg/L，
流水冲洗返蓝后，再用伊红染色5 min；依次经梯度乙醇
CCF剂量根据前期预实验得出）。各组细胞于培养箱中
脱水 5 min、二甲苯清洗 10 min 后，用中性树脂封片，使
培养24 h，进行后续实验。细胞每组设5个复孔，实验重
用显微镜观察小鼠子宫内膜结构及蜕膜化情况。
复3次。
2.2.2 敲低SGK2后细胞增殖水平检测 2.3.4 小鼠子宫内膜组织WNK信号通路及蜕膜化相关
取对数生长期的细胞，按“2.2.1”项下方法分组、转 蛋白和mRNA的检测
染、给药，按“2.1.2”项下方法检测各组细胞的存活率。 分离各组小鼠的右侧子宫内膜组织，按“2.1.4”项下
2.2.3 敲低SGK2后细胞WNK信号通路及蜕膜化相关 方法检测各组小鼠子宫内膜组织WNK信号通路及蜕膜
蛋白和mRNA的检测 化相关蛋白和mRNA的表达水平。
取对数生长期的细胞，按“2.2.1”项下方法分组、转 2.3.5 小鼠子宫内膜组织线粒体膜电位的检测
染、给药，按“2.1.4”项下方法检测各组细胞中WNK信号 采用流式细胞仪检测。另取各组小鼠的左侧子宫
通路及蜕膜化相关蛋白和mRNA的表达水平。 内膜组织，剪碎裂解后离心，取适量上清液，加入96孔板
2.2.4 敲低SGK2后细胞线粒体膜电位检测 中，向每孔加入等体积的荧光探针工作液，于 37 ℃、
采用流式细胞仪检测。取对数生长期的细胞，按 5%CO2条件下避光孵育 30 min；以 PBS 洗涤 2～3 次后，
“2.2.1”项下方法分组、转染、给药。培养24 h后，收集细 按“2.2.4”项下方法检测各组小鼠的线粒体膜电位。

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