Page 30 - 《中国药房》2025年19期
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海马组织，采用 Trizol 试剂提取组织中的总 RNA，使用                     白的表达。将 Sham 组、OVX 组、ZSD-L 组小鼠（每组 3
          NanoDrop 2000 软件测定 RNA 的浓度和纯度。使用                    只）的海马组织石蜡切片脱蜡至水，用抗原修复液
          Bioanalyzer 2100 软件评估 RNA 的完整性，并使用变性               （pH7.4）预处理，3%H2O2孵育 15 min 以阻断内源性过氧

          琼脂糖凝胶电泳进行确认。本研究使用的所有RNA样                            化物酶，再用 PBS 冲洗 3 次。逐滴加入 Nrf2 一抗（稀释
          品均经过质量评估，满足相关标准。本研究委托杭州联                            比例为1∶500），4 ℃孵育过夜。PBS冲洗后，加入荧光二
          川生物技术股份有限公司进行转录组测序。对转录组                             抗（稀释比例为1∶500）避光孵育50 min，再用PBS冲洗，
          测序的原始数据进行过滤，筛选得到高质量数据信息；                            滴加 DAPI 避光孵育 10 min，用 PBS 冲洗后加入抗荧光
          以|log2差异倍数（fold change，FC）|＞0.263、P＜0.05为标          淬灭封片剂封片。将切片置于荧光显微镜下观察并采
                             [15]
          准筛选差异表达基因 。对差异表达基因进行 KEGG                           集图像，采用Image J软件分析，以Nrf2蛋白荧光强度与
          通路富集分析，从而获取关键通路信息，并对关键基因                            DAPI 荧光强度的比值表示 Nrf2 的荧光强度，Nrf2 的荧
          进行聚类热图分析。                                           光强度越强表明蛋白表达水平越高。
              结果显示，与 Sham 组比较，OVX 组小鼠海马组织                         结果（图 3）显示，与 Sham 组（0.992±0.009）比较，
          中共有 1 248 个差异表达基因，其中 381 个上调、867 个                  OVX 组 小 鼠 海 马 组 织 中 Nrf2 的 荧 光 强 度（0.852±
          下调。与 OVX 组比较，ZSD-L 组小鼠海马组织中共有                       0.051）显著降低（P＜0.01）；与OVX组比较，ZSD-L组小
          1 829 个差异表达基因，其中 1 206 个上调、623 个下调。                 鼠海马组织中Nrf2的荧光强度（0.977±0.018）显著升高
          KEGG通路富集分析结果显示，差异表达基因主要富集                          （P＜0.01）。
          于神经活性配体-受体相互作用、磷脂酰肌醇信号系统                            2.2.8 海马组织中Akt/Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表

          等信号通路。与 OVX 组比较，ZSD-L 组小鼠海马组织                       达检测
          中抗氧化应激关键转录因子 Nrf2 的基因 Nfe2l2 的转录                        为进一步验证ZSD治疗围绝经期失眠的作用机制，
          水平显著升高（P＜0.05），提示 ZSD 能够激活 Nrf2 信号                  根据网络药理学预测和转录组测序结果，采用 Western
          通路。此外，与 Akt 相关的基因 Akt2 及 HO-1 的基因                   blot 法检测小鼠海马组织中 Akt/Nrf2/HO-1 信号通路相
          Hmox1 的转录水平在 ZSD-L 组小鼠海马组织中均有所                      关蛋白的表达。取 Sham 组、OVX 组、ZSD-L 组小鼠（每
          上调，表明 ZSD 给药后 Akt/Nrf2/HO-1 信号通路明显激                 组3只）的海马组织，提取组织中总蛋白，采用BCA法测

          活，与网络药理学研究结果基本一致，体现了本研究分                            定总蛋白浓度，并将蛋白进行高温变性。取 20 μg 蛋白
          析方法的可靠性。结果见图2。                                      上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
          2.2.7 海马组织中Nrf2蛋白表达的免疫荧光法检测                        （在 80 V 电压下预电泳 20 min，随后将电压调至 120 V
              根据网络药理学和转录组测序结果可知，氧化应激                          直至电泳结束），将分离后的蛋白转移至 0.22 μm 的
          信号通路在ZSD治疗围绝经期失眠中发挥重要作用，而                           PVDF膜上（电流350 mA，时间90 min），用5%牛血清白
          Nrf2 是调控抗氧化应激的关键转录因子。为验证 ZSD                        蛋白在室温下封闭 1 h。加入 Nrf2、HO-1、Akt、p-Akt、
          是否通过激活Nrf2缓解OVX小鼠海马组织氧化应激损                          β-actin一抗（稀释比例分别为1∶2 000、1∶5 000、1∶5 000、
          伤，本研究采用免疫荧光法检测小鼠海马组织中Nrf2蛋                          1∶2 000、1∶5 000），在 4 ℃下孵育过夜；洗膜，加入二抗

                                                                                                 group  group
                                                                                                       1.5  OVX组
                                                                                                 Gclm  1 0.5  ZSD-L组
                                                                                                       0
                                                                                                       －0.5
             7.5                                                                                 Sod1  －1
                                                                                                       －1.5
                                               15
                                                                                                 Pik3a  ＊
                                                                                                 Nfe2l2
            －log 10  P-value  5.0    Significant Up  －log 10  P-value  10  Significant Up        Akt2 ＊  ＊
                                                                       Significant Down
                                     Significant Down
                                                                       Up
                                     Up
                                     Down
                                                                       Down
                                                                       Non-significant
                                     Non-significant
                                                                                                 Hmox1
             2.5
                                                5
                                                                                                 Pdk1
                                                                                                 Akt1
              0                                 0
                                                                                                 Akt3
                  －10                   0                    10  －10                0               10
                       log 2  FC                          log 2  FC                              Keap1
             A. OVX组与Sham组差异表达基因的火山图         B. ZSD-L组与OVX组差异表达基因的火山图           C. ZSD-L组与OVX组关键基因的聚类热图
             ＊：与Akt/Nrf2/HO-1信号通路相关的基因。
                                                  图2 转录组测序结果
          · 2376 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 19                            中国药房  2025年第36卷第19期
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