Page 55 - 《中国药房》2025年18期
P. 55

2.2 心功能指标检测                                        总蛋白，以BCA法分析蛋白浓度，将蛋白样品与上样缓
              末次给药 12 h 后对所有大鼠进行心功能检测，用                      冲液混合后于沸水中变性5 min，电泳分离蛋白，通过湿
          4%的戊巴比妥钠将大鼠麻醉后用彩色多普勒超声诊断                           转法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉封闭2
          仪检测大鼠的左室射血分数（left ventricular ejection             h后，加入LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p62、cleaved caspase-3、Parkin、
          fraction，LVEF）、左室舒张末容积（left ventricular end-       PINK1和β-actin一抗（稀释比例均为1∶4 000），4 ℃下孵
          diastolic volume，LVEDV）、左室收缩末容积（left ven‐          育过夜；次日，用 TBST 缓冲液洗涤后，加入相应二抗
          tricular end-systolic volume，LVESV）、平均动脉压（mean    （稀释比例为 1∶1 500），室温孵育 2 h；ECL 显影后，采
          arterial pressure，MAP）。                            用 Image-Pro Plus 软件分析，以目的蛋白与内参蛋白
          2.3 样本采集                                          （β-actin）的灰度值比值表示各目的蛋白的表达量，并计
              心功能检测结束后，将所有大鼠麻醉后于腹主动脉                         算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值。
          采血3 mL，然后颈椎脱臼处死，取完整心脏，备测。                          2.11 统计学分析
          2.4 血清中心肌损伤指标检测                                        采用 GraphPad Prism 8.0.1 软件对数据进行分析。
              分别取“2.3”项下各组 10 只大鼠的新鲜血液适量，                    实验数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分
          以 3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，按试剂盒说明书               析，组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          操作，检测血清中CK-MB、LDH、cTnI、cTnT水平。                     3 结果
          2.5 心肌组织中炎症因子水平检测
                                                             3.1 大鼠心功能指标比较
              分别取“2.3”项下各组5只大鼠的左心室组织适量，
                                                                 与Con组比较，CHD组大鼠的LVEDV和LVESV均
          4 ℃匀浆后以3 500 r/min离心10 min，取上清液，按试剂
                                                             显著升高，LVEF 和 MAP 均显著降低（P＜0.05）。与
          盒说明书操作，检测心肌组织中 TNF-α、IL-10、IL-1β
                                                             CHD 组 比 较 ，Pac-L 组 和 Pac-H 组 大 鼠 的 LVEDV 和
          水平。                                                LVESV 均显著降低，LVEF 和 MAP 均显著升高（P＜
          2.6 心肌组织形态观察
                                                             0.05），且Pac-H组改变更显著（P＜0.05）。与Pac-H组比
              分别取“2.3”项下各组5只大鼠的左心室组织适量，
                                                             较，Pac-H+3-MA 组大鼠的 LVEDV 和 LVESV 均显著升
          用 4% 多聚甲醛固定、乙醇脱水、二甲苯透明后，石蜡包
                                                             高，LVEF和MAP均显著降低（P＜0.05）。结果见表1。
          埋切片（4 μm）。切片置于载玻片上，经脱蜡、水化处理
                                                                 表1 各组大鼠心功能指标比较（x±s，n＝10）
          后，进行 HE 染色，最后经脱水、透明、封片后，使用显微
                                                              组别         LVEF/%   LVEDV/mL  LVESV/mL  MAP/mmHg
          镜观察心肌组织形态。
                                                              Con组      1.17±0.13  3.26±0.31  1.32±0.15  128.64±15.27
          2.7 心肌细胞线粒体自噬囊泡观察                                   CHD组      0.26±0.03 a  6.78±0.62 a  4.71±0.38 a  53.12±4.86 a
              分别取“2.3”项下各组5只大鼠的右心室组织适量，                       Pac-L组    0.54±0.04 b  5.32±0.48 b  3.56±0.34 b  76.83±7.42 b
                                                              Pac-H组    0.85±0.07 bc  4.19±0.37 bc  2.28±0.26 bc  102.58±9.45 bc
          分别用 3% 戊二醛和 1% 四氧化锇固定、丙酮脱水后，渗
                                                              Pac-H+3-MA组  0.47±0.03 d  5.67±0.50 d  3.94±0.37 d  71.43±6.53 d
          透，包埋，切片（50～60 nm）。切片置于水面漂浮伸展，
                                                                a：与Con组比较，P＜0.05；b：与CHD组比较，P＜0.05；c：与Pac-L
          再转移至铜网，用2%醋酸铀染色30 min，枸橼酸铅再染                       组比较，P＜0.05；d：与Pac-H组比较，P＜0.05；1 mmHg＝133.32 Pa。
          色15 min后，使用透射电镜观察心肌细胞线粒体自噬囊                        3.2 大鼠血清中心肌损伤指标比较
          泡数量，并用 Image J 软件统计单位面积线粒体自噬囊
                                                                 与 Con 组比较，CHD 组大鼠血清中 CK-MB、LDH、
          泡数量（5个视野）。
                                                             cTnI 和 cTnT 水平均显著升高（P＜0.05）。与 CHD 组比
          2.8 心肌组织中氧化应激指标水平检测
                                                             较，Pac-L 组和 Pac-H 组大鼠血清中 CK-MB、LDH、cTnI
              取“2.3”项下各组剩余5只大鼠的右心室组织适量，
                                                             和 cTnT 水平均显著降低（P＜0.05），且 Pac-H 组降低更
          在预冷生理盐水中匀浆，以 3 000 r/min 离心 10 min，收
                                                             显著（P＜0.05）。与 Pac-H 组比较，Pac-H+3-MA 组大鼠
          集上清液，按试剂盒说明书操作，检测心肌组织中CAT、
                                                             血清中 CK-MB、LDH、cTnI 和 cTnT 水平均显著升高
          SOD活性和ROS、MDA水平。
                                                            （P＜0.05）。结果见表2。
          2.9 心肌组织细胞凋亡检测
                                                             表2 各组大鼠血清中 CK-MB、LDH、cTnI 和 cTnT 水
              取“2.6”项下各组大鼠的心肌组织切片，置于蛋白酶
                                                                  平比较（x±s，n＝10）
          K 工作液中孵育 30 min，再滴加 TUNEL 反应混合液，避
                                                              组别       CK-MB/（U/mL）  LDH/（U/mL）  cTnI/（ng/mL）  cTnT/（ng/mL）
          光孵育60 min，洗涤终止反应，二氨基联苯胺显色，苏木                        Con组      0.42±0.05  1.48±0.16  0.52±0.07  65.84±3.71
          精复染20 s，盐酸乙醇分化，乙醇脱水，二甲苯透明后封                         CHD组      1.76±0.19 a  5.34±0.47 a  1.46±0.12 a  126.38±7.19 a
          片，使用显微镜观察心肌组织细胞凋亡情况，并用                              Pac-L组    1.28±0.14 b  3.72±0.34 b  1.13±0.09 b  108.64±5.23 b
                                                              Pac-H组    0.74±0.06 bc  2.29±0.25 bc  0.81±0.06 bc  93.16±4.37 bc
          Image J软件分析细胞凋亡率。
                                                              Pac-H+3-MA组  1.39±0.17 d  4.13±0.38 d  1.24±0.11 d  112.57±6.48 d
          2.10 心肌组织中线粒体自噬和凋亡相关蛋白表达检测                            a：与Con组比较，P＜0.05；b：与CHD组比较，P＜0.05；c：与Pac-L
              取“2.7”项下各组5只大鼠的左心室组织适量，提取                      组比较，P＜0.05；d：与Pac-H组比较，P＜0.05。


          中国药房  2025年第36卷第18期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 18    · 2269 ·
   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59   60