Page 58 - 《中国药房》2025年17期
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pcDNA-NC 组使用 Lipofectamine 2000 试剂将 pcDNA-          种于 96 孔板中，常规培养至贴壁。按“2.3”项下方法分
          NC 质粒转染至 KB、CAL27 细胞，24 h 后再使用 400                  组并加入对应药物，预处理靶细胞 48 h 后，弃去含药培
          μg/mL 的枸杞多糖处理 48 h；高浓度枸杞多糖+pcDNA-                   养基，加入同批次药物预处理48 h的细胞因子诱导杀伤
                                                                        5
          TIM3 组使用 Lipofectamine 2000 试剂将 pcDNA-TIM3          细胞（1×10 个/孔），补充新鲜含药培养基至总体积为
          质粒转染至 KB、CAL27 细胞，24 h 后再使用 400 μg/mL               100 μL，启动共培养（此时为共培养 0 h）。同时设置释
                                                                                                 4
          的枸杞多糖处理 48 h。质粒转染按照 Lipofectamine                   放照组：（1）靶细胞自发释放组（1×10 个靶细胞/孔
          2000试剂说明书进行，KB、CAL27细胞的转染效率均在                       +100 μL无药培养基）；（2）效应细胞自发释放组（1×10                5
                                           [11]
          70%～80%之间，与相关文献报道相符 。                               个效应细胞/孔+100 μL 无药培养基）；（3）最大释放组
                                                                    4
          2.4 细胞增殖能力考察                                       （1×10 个靶细胞/孔+100 μL无药培养基；共培养结束前
          2.4.1 克隆形成实验                                        1 h加入Triton X-100，37 ℃孵育1 h）。释放照组与实验
              取对数生长期 KB、CAL27 细胞，接种于培养皿中                      组同步培养（不加药）。共培养48 h后，以300×g离心5
                3
         （2×10 个/皿），细胞分组、给药同“2.3”项下，持续培养2                     min，小心吸取每孔上清液 50 μL 至新的 96 孔板中。向
          周，肉眼可观察到克隆形成后弃去培养液，使用磷酸盐                            所有检测孔中加入乳酸脱氢酶释放试剂孵育 1 min，随
          缓冲液（PBS）清洗后用4%多聚甲醛固定，30 min后加入                      后加入乳酸脱氢酶检测液避光孵育30 min，最后使用酶
          Giemsa 染液进行染色，10 min 后再次进行清洗并干燥，                    标仪测定各孔A值（波长450 nm处），并计算T细胞杀伤
          然后使用倒置显微镜进行观察，计算克隆形成率。克隆                            率。T 细胞杀伤率（%）＝（实验组 A 值－靶细胞自发释
          形成率（%）＝形成的克隆数/接种的细胞数×100%。                          放组 A 值－效应细胞自发释放组 A 值）/（最大释放组 A
          2.4.2 MTT实验                                         值－靶细胞自发释放组A值）×100%。
            取对数生长期 KB、CAL27 细胞，接种于 96 孔板中                     2.7 细胞上清液中IFN-γ、IL-2水平测定
         （2×10 个/孔），细胞分组、给药、培养同“2.3”项下，并设置                        采用 ELISA 法测定。取对数生长期 KB、CAL27 细
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          空白组（不含细胞的培养基）。随后分别加入 5 mg/mL                        胞，接种于 6 孔板中（2×10 个/孔），常规培养至贴壁。
          MTT溶液（20 μL/孔）进行培养，4 h后弃去上清液，然后                     按“2.3”项下方法分组并加入对应药物，预处理靶细胞
          加入二甲基亚砜（150 μL/孔）进行培养，10 min后使用酶                    48 h后，弃去含药培养基。每孔加入经同批次药物预处
                                                                                      6
          标仪在波长570 nm处对每个孔的A值进行测定，并计算                         理48 h的CD8⁺T细胞（2×10 个/孔），同时补充新鲜含药
                                                              培养基至适宜体积，启动共培养（此时为共培养 0 h）。
          细胞增殖抑制率。增殖抑制率（%）＝（对照组 A 值－实
                                                              共培养 48 h 后，以 300×g 离心 5 min，收集上清液。按
          验组A值）/（对照组A值－空白组A值）×100%。
                                                              ELISA试剂盒说明书操作检测细胞上清液中IFN-γ、IL-2
          2.5 细胞迁移、侵袭能力测定
                                                              水平。
          2.5.1 迁移能力考察
                                                              2.8 细胞中TIM3、Gal-9 mRNA表达测定
              取对数生长期 KB、CAL27 细胞，接种于 6 孔板中
                                                                  采用 qRT-PCR 法测定。取对数生长期 KB、CAL27
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         （2×10 个/孔），细胞分组、给药、培养同“2.3”项下。培
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                                                              细胞，接种于 6 孔板中（2×10 个/孔），细胞分组、给药、
          养结束后，使用枪头制造划痕，然后加入 PBS 冲洗被划
                                                              培养同“2.3”项下。培养结束后，采用Trizol试剂提取细
          掉的细胞，并置于显微镜下观察、拍照（0 h），接着将细胞
                                                              胞中总 RNA，并测定其浓度，然后使用反转录试剂盒将
          放入培养箱（37 ℃，5%CO2 ）中进行培养，24 h 后再次置
                                                              其反转录为 cDNA，并以 cDNA 为模板进行 qRT-PCR 反
          于显微镜下观察、拍照。使用 Image J 软件分析 0、24 h
                                                              应。反应体系：2×SYBR Green Mix 10 μL，正、反向引
          的划痕宽度，并计算划痕愈合率。划痕愈合率（%）＝（0
                                                              物各 0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。反应条件：
          h划痕宽度－24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。
                                                              95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 10 s、60 ℃退火/延伸 30 s，
          2.5.2 侵袭能力考察
                                                              循环 40 次。以 β-actin 为内参，采用 2     －ΔΔCt 法计算各目的
              取对数生长期 KB、CAL27 细胞，接种于 6 孔板中
                                                              基因的表达水平。引物序列及产物扩增长度见表1。
         （2×10 个/孔），细胞分组、给药、培养同“2.3”项下。培
                5
                                                                        表1 引物序列及产物扩增长度
          养结束后，将细胞（200 μL）加到 Transwell 小室的上室
                                                              基因    正向引物（5′→3′）      反向引物（5′→3′）     产物扩增长度/bp
         （含有Matrigel基质胶），并在Transwell小室的下室中加                   TIM3  CTACATCGGAGCAGGGTA  CTGAGGGAGGGAGGTTG  197
          入培养基（含 20% 胎牛血清，添加量 600 μL），继续培养                    Gal-9  TCTGGGACTATTCAAGGAGGTC  CAGGAGGCATTGCTGATGAT  235
          24 h；清洗上室，接着使用4%多聚甲醛进行固定，20 min                     β-actin  CTCGCCTTTGCCGATCC  GGGGTACTTCAGGGTGAGGA  126
          后进行染色（以 0.1% 结晶紫染液染 20 min）。使用显微                    2.9 细胞中IDO1、PD-L1、TIM3、Gal-9蛋白表达检测
          镜观察，每次随机选择5个视野进行侵袭细胞计数。                                 采 用 Western  blot 法 检 测 。 取 对 数 生 长 期 KB、
                                                                                             5
          2.6 T细胞杀伤率测定                                        CAL27细胞，接种于6孔板中（2×10 个/孔），细胞分组、
                                                  4
              取对数生长期 KB、CAL27 细胞，以 1×10 个/孔接                  给药、培养同“2.3”项下。培养结束后，加入RIPA裂解液
          · 2136 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 17                            中国药房  2025年第36卷第17期
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