Page 55 - 《中国药房》2025年15期
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2.4 细胞迁移能力检测                                       液至新的离心管中。按照BCA试剂盒说明书方法测定
              采用细胞划痕实验检测。取“2.2”项下对数生长期                       蛋白浓度，将每个蛋白上样量定量至20 μg。上样前，蛋
          的T24细胞，按照每孔5×10 个接种于6孔板中，当细胞                       白于100 ℃变性10 min，然后进行凝胶电泳、转膜；封闭
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          融合度＞90% 时，使用 10 μL 移液管尖端在细胞单层上                     液封闭 20 min 后，以 TBST 洗膜 2 次，每次 5 min，加入
          等距划痕3次，磷酸盐缓冲液清洗2遍；按照“2.3”项下分                       VEGF、MMP2、MMP9、GLUT1、HK2、PKM2、NF- κB、
          组处理细胞，并在同一位置下用倒置显微镜拍照记录给                           HIF-1α、GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃孵育
          药 0、24 h 时的划痕图片，利用 Image J 软件计算细胞划                 过夜；以TBST洗膜 3 次，每次 5 min，加入相应二抗（稀
          痕愈合率。细胞划痕愈合率（%）＝（0 h 时划痕面积－                        释比例为 1∶ 5 000）孵育1 h，以TBST洗膜3次，每次10
          24 h时划痕面积）/0 h时划痕面积×100%。                          min；经 ECL 显色、成像显影后，采用 Image J 软件分析，
          2.5 线粒体膜电位检测                                       以目标蛋白与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值的比值表
              取“2.2”项下对数生长期的 T24 细胞，按照每孔 2×                  示目标蛋白的表达水平。上述实验重复3次。
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          10 个接种于 6 孔板中，培养 24 h 后弃去培养液。按照
                                                             2.9 统计学分析
         “2.3”项下分组处理细胞24 h后，用磷酸盐缓冲液洗涤2                           采用 GraphPad Prism 9.5 软件进行统计分析，计量
          次，加入 JC-1 染色工作液 1 mL 进行染色，并在 37 ℃下                 资料满足正态分布以x±s表示，多组间比较采用单因素
          避光孵育 20 min。完成染色后，弃去上清液，用预冷的
                                                             方差分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准
          1×JC-1染色缓冲液洗涤细胞2次，以确保去除未结合的
                                                             α＝0.05。
          染料。随后加入 2 mL 无血清培养液，将各组细胞置于                        3 结果
          荧光显微镜下检测 JC-1 单体（绿色荧光）及 JC-1 聚合物
                                                             3.1 丹皮酚对T24细胞迁移能力的影响
         （红色荧光）的荧光强度并采集图像。绿色荧光表示线
                                                                 对照组、丹皮酚低剂量组、丹皮酚中剂量组、丹皮酚
          粒体膜电位下降，红色荧光表示线粒体膜电位正常。以
                                                             高剂量组、顺铂组细胞划痕愈合率分别为（59.116±
          红绿荧光强度的比值反映线粒体膜电位的变化情况。
          2.6 ATP浓度检测                                        4.127）%、（33.587±1.617）%、（23.322±3.826）%、（25.257±
                                                             1.316）%、（29.865±1.447）%。与对照组比较，丹皮酚
              取“2.2”项下对数生长期的 T24 细胞，按照每孔 2×
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          10 个接种于 6 孔板中，培养过夜。按照“2.3”项下分组                     中、高剂量组和顺铂组细胞划痕愈合率均显著降低（P＜
          处理细胞 24 h 后，收集细胞并提取总蛋白。然后根据                        0.01），提示丹皮酚及顺铂均具有抑制T24细胞迁移的作
          ATP 分析试剂盒的说明书，对 T24 细胞的 ATP 浓度进行                   用。结果见图1。
                                                             3.2 丹皮酚对 NF-κB/HIF-1α 信号通路以及迁移相关
          定量分析。
          2.7 乳酸含量检测                                         蛋白表达的影响
              采用比色法检测。按照“2.3”项下分组处理细胞24                          与对照组比较，丹皮酚各剂量组细胞中 HIF-1α（丹
          h 后，收集细胞并超声破碎制备匀浆待测。严格按照试                          皮酚低剂量组除外）、MMP9、MMP2、NF-κB、VEGF蛋白
          剂盒说明书步骤，在530 nm波长处检测吸光度值，计算                        表达水平均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01）。结果见表
          细胞中的乳酸含量。                                          1、图2。
          2.8 NF-κB/HIF-1α 信号通路、迁移相关蛋白以及有氧                   3.3 丹皮酚对T24细胞代谢的影响
          糖酵解关键酶表达的检测                                        3.3.1 丹皮酚对T24细胞线粒体膜电位的影响
              采用 Western blot 法检测。按照“2.3”项下分组（不                  与对照组比较，丹皮酚中、高剂量组细胞线粒体红
          设顺铂组）处理细胞，培养24 h后，每孔加入200 μL强裂                     绿荧光强度比值均显著降低（P＜0.01）。结果见表
          解液裂解 10 min，以 12 000 r/min 离心 20 min，转移上清          2、图3。





          0 h








          24 h



                   A.对照组           B.丹皮酚低剂量组           C.丹皮酚中剂量组          D.丹皮酚高剂量组              E.顺铂组
                                          图1 各组T24细胞划痕实验结果（×10）


          中国药房  2025年第36卷第15期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 15    · 1873 ·
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