Page 37 - 《中国药房》2025年15期
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研磨，加入 Trizol 试剂提取结肠组织总 RNA，将 RNA 逆                 cell，SMC）（6 000 倍和 30 000 倍）、缝隙连接结构（8 000
          转录为 cDNA。在 cDNA（2 μL，以 DEPC 水稀释至 10                倍和40 000倍）图像。
          ng/μL）中加入 0.2 μmol/L 基因上下游引物、10 μL 的               2.9 统计学方法
          SYBR Green试剂、7.8 μL的DEPC水，混匀后离心，再进                     采用 SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料满足
          行PCR反应。具体程序为95 ℃，5 min；94 ℃，10 s；60～               正态分布以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分
          66 ℃，30 s；循环 40 次。以 β-actin 为内参，采用公式               析，进一步两两比较采用LSD-t检验；计量资料不符合正

          2 －ΔΔCt 计算各目标基因mRNA的相对表达量。引物序列                     态分布以 M（P25，P75 ）表示，多组间比较采用非参数
          及产物长度见表1。                                          Kruskal-Wallis  H 检 验 ，进 一 步 两 两 比 较 采 用 Mann-
                   表1 PCR引物序列及产物长度                           Whitney U检验。计数资料以例数或率（%）表示，采用χ                 2

          基因            引物序列（5′→3′）              产物长度/bp     检验。检验水准α＝0.05。
          ASIC3         上游：GCTCCTCTTCCAAATCCTG     106       3 结果
                        下游：CTCAAACGGGGTCTCTTCT               3.1 芍药甘草汤对大鼠肠道传输功能的影响
          ERK1          上游：CCACAAAACTTGACAGACCA    108
                        下游：CAGAGAAGGAGCAGGTAGGA                  与空白组比较，造模组大鼠排出首粒黑便时间显著
          ERK2          上游：ACACGCCTTTCCTTGATTT     125       延长[（124.25±89.58）min vs. （387.92±103.68）min，P＜
                        下游：CACATCTTTCTTGGCATTTCT
          β-actin       上游；TGAGGCTGGTGATAAATGG     119       0.01]，提示STC大鼠模型构建成功。
                        下游：CAAAGAGGGCAAGAACACA                   空白组、模型组、乳果糖组、芍药甘草汤组、联合抑
          2.7 大鼠结肠组织中 ASIC3、ERK1/2、p-ERK1/2 蛋白               制组大鼠肠道推进率分别为（80.22±8.30）%、（63.86±
          表达检测                                               7.76）% 、（65.64±9.72）% 、（76.29±10.03）% 、（67.00±
              采 用 Western  blot 法 检 测 。 取“2.5”项 下 部 分 于       9.28）%。与空白组比较，模型组大鼠肠道推进率显著降
          －80 ℃保存的大鼠结肠组织（n＝6），加入 RIPA 裂解液                    低（P＜0.01）；与模型组比较，芍药甘草汤组大鼠肠道推
          浸没组织并于低温组织研磨仪中研磨。收集离心后的组                           进率显著升高（P＜0.01）。
                                                             3.2 芍药甘草汤对大鼠内脏敏感性的影响
          织匀浆上清液，采用BCA法调整蛋白浓度（2～3 μg/μL），
          将蛋白变性后，进行凝胶恒压电泳、转膜。洗去膜上残                               空白组、模型组、乳果糖组、芍药甘草汤组、联合抑制
                                                             组大鼠内脏痛阈值分别为（70.00±9.19）、（85.00±17.86）、
          留转膜液，以 5%BSA 封闭 1 h，加入 ASIC3、ERK1/2、p-
                                                            （67.78±5.44）、（48.33±5.05）、（68.89±9.11）mmHg。
          ERK1/2 一抗（稀释比例均为 1∶1000）和 β-actin 抗体（稀
                                                             与空白组比较，模型组大鼠内脏痛阈值显著升高（P＜
          释比例为 1∶5 000）孵育过夜；TBST 漂洗膜上未结合的
                                                             0.05）；与模型组比较，乳果糖组和芍药甘草汤组大鼠内
          一抗，加入相应二抗（稀释比例为 1∶2 000），室温孵育
                                                             脏痛阈值均显著降低（P＜0.01）；与芍药甘草汤组比较，
          1 h；TBST洗膜，滴加ECL显影液于暗室中曝光显影，采
                                                             联合抑制组大鼠内脏痛阈值显著升高（P＜0.05）。
          集蛋白条带图像。采用 Image J 软件分析，以目标蛋白
                                                             3.3 芍药甘草汤对大鼠结肠组织中ASIC3蛋白表达的
          与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示目标蛋白的
                                                             影响
          相对表达量。
                                                                 空白组、模型组、乳果糖组、芍药甘草汤组、联合抑
          2.8 结肠ENS-Cajal间质细胞-平滑肌细胞网络超微结
                                                             制组大鼠 ASIC3 阳性面积占比分别为（20.41±5.91）%、
          构观察
                                                            （6.71±4.82）%、（9.00±2.30）%、（16.23±5.10）%、（8.51±
              取“2.5”项下部分于－80 ℃保存的大鼠结肠组织
                                                             4.27）%。大鼠结肠组织中的ASIC3阳性表达呈棕黄色，
         （n＝6），置于2.5%戊二醛固定液中固定过夜，以PBS漂
                                                             主要表达在黏膜下层及肌层。与空白组比较，模型组大
          洗；用 1% 四氧化锇 20 ℃固定 2 h，再以 PBS 漂洗样本，
                                                             鼠 结 肠 组 织 中 ASIC3 蛋 白 表 达 水 平 显 著 降 低（P＜
          完成后以梯度乙醇-丙酮脱水；脱水后包埋，于37 ℃烘箱                        0.05）；与模型组比较，芍药甘草汤组大鼠结肠组织中
          中过夜，再于60 ℃烘箱中聚合48 h。样本包埋块以超薄                       ASIC3蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与芍药甘草汤
          切片机切片（60～90 nm），展开后捞至铜网，在室温下先                      组比较，联合抑制组大鼠结肠组织中ASIC3蛋白表达水
          后以醋酸铀、柠檬酸铅染色，室温干燥过夜。采用透射                           平显著降低（P＜0.01）。结果见图1。
          电镜观察大鼠结肠组织超微结构并采集图像。每张铜                            3.4 芍药甘草汤对大鼠结肠组织中 ERK1、ERK2、
          网先于 6 000 倍下观察目标区域整体结构情况，再分别                       ASIC3 mRNA表达的影响
          采集目标区域下Cajal间质细胞（interstitial cell of Cajal，           与空白组比较，模型组大鼠结肠组织中 ERK1、
          ICC）（6 000倍和30 000倍）、平滑肌细胞（smooth muscle           ERK2、ASIC3 mRNA 相对表达量均显著降低（P＜0.05


          中国药房  2025年第36卷第15期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 15    · 1855 ·
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