Page 36 - 《中国药房》2025年15期
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实验动物生产许可证号为 SCXK（京）2019-0010。实验                     积生理盐水。灌胃和腹腔注射均为每日1次，连续干预
          动物饲养于成都中医药大学温江校区药理学实验室动                             14 d。
          物饲养中心。大鼠饲养在相对湿度（55±10）%、相对温                         2.3 肠道传输功能检测
          度（25±2）℃、12 h/12 h明暗交替、每小时10～15次通风                      造模结束后大鼠立即禁食 24 h，然后以墨汁灌胃
          换气的环境中，以普通颗粒饲料喂养，饮用水为纯净水。                          （10 mL/kg），记录从灌胃结束到排出首粒带活性炭粪便
          所有实验程序均经四川省实验动物学会伦理委员会批                             所需的时间，即为首粒黑便排出时间。上述指标检测
          准（批准号为P202303201）。                                  后，采用随机数字表法每组选取 4 只大鼠禁食、不禁水
          2 方法                                                24 h，以墨汁灌胃（10 mL/kg），30 min后予以戊巴比妥钠
          2.1 药液和墨汁的制备                                       （30 mg/kg）腹腔注射麻醉，颈椎脱臼处死，随后立即置于

             （1）芍药甘草汤：根据本课题组前期临床研究，称取                         手术台上解剖，快速取出其全部肠道，在无张力的状态
                                                              下测量大鼠的肠道全长及墨汁在肠道内推进的长度，并
          生白芍 18 g、生甘草 6 g，第一次煎煮前先将饮片用 8 倍
                                                              计算肠道推进率。肠道推进率（%）＝黑染肠道长度/肠
          体积RO纯水浸泡30 min，加热回流收集药液，第二次以
                                                                          [6]
                                                              道全长×100% 。
          6 倍体积 RO 纯水加热回流再次收集药液。合并 2 次药
                                                              2.4 内脏敏感性检测
          液，冷却后，用200目筛过滤，取滤液。滤液减压浓缩成
                                                                  使用自制的压力球囊及自制的透明鼠笼进行检
          质量浓度为1.5 g/mL的浓缩液（以生药量计），于4 ℃冰
                                                              测 。干预结束后，“2.3”项下部分大鼠（n＝6）禁食 12 h
                                                                [8]
          箱保存备用，使用前恢复至室温。（2）复方地芬诺酯溶
                                                              后使用乙醚麻醉，将压力球囊放入大鼠肛门内约5 cm处
          液：将复方地芬诺酯片研磨成细粉，用生理盐水配制成
                                                              后固定，再将大鼠放入透明鼠笼。待大鼠苏醒及适应环
          质量浓度为1.5 mg/mL的混悬液，即配即用。（3）墨汁：将
                                                              境后，加压球囊，分别在20、40、60、80 mmHg（1 mmHg＝
          阿拉伯胶50 g与水400 mL混合，煮沸至澄清透明，再加活
                                                              133.322 Pa）压力下保持30 s进行腹壁撤退反射（abdomi‐
          性炭25 g，混匀并煮沸 3 次，冷却，用水定容至 500 mL，
                                                              nal withdrawal reflex，AWR）评分。AWR 评分为 0 分：大
          4 ℃下保存，使用前放至常温并搅拌摇匀。（4）乳果糖溶
                                                              鼠无明显变化；1分：大鼠情绪不稳定，身体静止不动，头
          液：取乳果糖口服液适量，用生理盐水制成质量浓度为
                                                              部偶尔扭动或上下运动；2 分：大鼠腹肌轻微回缩，但未
          208.4 mg/mL 的溶液，即配即用。（5）ASIC3 抑制剂：取
                                                              离开鼠笼底面；3 分：大鼠腹肌较强烈收缩，部分抬离鼠
          ASIC3抑制剂盐酸阿米洛利适量，以生理盐水配制成质
                                                              笼底面；4分：大鼠腹肌强烈收缩，腹部呈弓形，完全抬离
          量浓度为2 μg/mL的阿米洛利溶液，避光，即配即用。
                                                              鼠笼底面，骨盆抬起。记录内脏痛阈值（AWR 评分＝3
          2.2 分组、造模与给药
                                                              时所对应的压力值）以反映内脏敏感性，重复检测3次，
              大鼠适应性喂养1周后，按体重随机分为空白组（12
                                                              每次间隔10 min。
          只）和造模组（48 只），雌雄各半。造模组大鼠参考相关
                                                              2.5 大鼠结肠组织中ASIC3的表达及分布观察
          文献  [6―7] ，采用复方地芬诺酯溶液灌胃[15 mg/（kg·d），每
                                                                  采用免疫组化染色观察。“2.4”项下实验结束后，取
          天 1 次，连续 14 d]构建 STC 模型，空白组大鼠灌胃等体
                                                              各组大鼠（n＝6）部分结肠组织（剩余部分置于－80 ℃保
          积生理盐水。造模后，若造模组大鼠出现体形干瘪瘦
                                                              存备用）用 4% 多聚甲醛固定，经梯度乙醇脱水、二甲苯
          小、毛发竖立、拱背、活动减少、粪便质量减轻、粪便颗粒
                                                              透明、蒸馏水清洗、石蜡包埋、脱蜡并水化后，进行切片；
          变细硬，大便 Bristol 评分较空白组显著变化，且首粒黑                      抗原修复切片，加入 ASIC3 抗体（稀释比例为 1∶100）
          便排出时间较空白组显著延长，则视为STC模型复制成                           4 ℃孵育过夜，以 PBS 洗涤，滴加 HRP 标记的山羊抗兔
          功。造模后，大鼠全部存活。将造模成功的大鼠随机分                            二抗（稀释比例为 1∶100）孵育，再以 PBS 洗涤。将洗涤
          为模型组、芍药甘草汤组、乳果糖组（阳性对照）、联合抑                          好的切片用 DAB 显色，经苏木素复染、梯度乙醇脱水、
          制组，雌雄各半，每组12只。给药剂量以儿童临床用药                           二甲苯透明后，以中性树胶封片。选取3个不同视野在
          剂量为基础，按人与大鼠等效剂量换算，给药剂量参考                            显微镜下观察，用数字扫描浏览软件CaseViewer采集显
          课题组前期实验用量。芍药甘草汤组、联合抑制组大鼠                            微图像，用数据分析系统计算图像中 ASIC3 阳性（呈棕
          灌胃芍药甘草汤浓缩液（1.5 g/mL），乳果糖组大鼠灌胃                       黄色）面积占比以反映ASIC3蛋白表达。
          乳果糖溶液（208.4 mg/mL），空白组和模型组大鼠灌胃                      2.6 大鼠结肠组织中 ASIC3、ERK1、ERK2 mRNA 表
          等体积生理盐水；所有药物均按大鼠体重以 0.01 mL/g                       达检测
          灌胃。此外，联合抑制组大鼠以配制好的阿米洛利溶液                                采用实时荧光定量 PCR 检测。取“2.5”项下部分
         （20 μg/kg）腹腔注射，其他各组大鼠同步腹腔注射等体                        于－80 ℃保存的大鼠结肠组织（n＝6），使用低温研磨仪


          · 1854 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 15                            中国药房  2025年第36卷第15期
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