Page 57 - 《中国药房》2025年14期
P. 57

心5 min，经0.22 μm微孔滤膜过滤，得到大鼠等效剂量3                    2.5 RAECs活力测定
          倍量的天麻芎苓止眩片药液。                                          取“2.3”项下 RAECs 的 96 孔板，吸弃上清后，每孔
              大鼠适应性喂养 7 d 后，按随机数字表法分为空白                      加入 10% CCK-8 工作液 20 μL，持续孵育 2～3 h 后，采
          组和中药组，每组6只。根据天麻芎苓止眩片成人每日                           用多功能酶标仪于 450 nm 波长处检测各孔 A 值，按
                                   [8]
          用量12 g，按体表面积折算法 计算大鼠等效给药剂量，                       “2.2”项下公式计算细胞存活率。
          即中药组大鼠按 0.8 g/（kg·d）灌胃相应药液，空白组大                    2.6 上清液中ET-1、NO水平检测
          鼠给予等体积蒸馏水，每日2次，连续3 d。末次给药1 h                           收集“2.3”项下分组、造模、给药后的 RAECs 上清
          后，大鼠行腹主动脉取血，以4 500 r/min离心10 min，收                 液，按照ELISA试剂盒说明书检测ET-1、NO水平。
          集血清，置于56 ℃水浴锅灭活处理30 min后，再以1 200                   2.7 线粒体活性氧检测
          r/min离心5 min；收集上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤                      取“2.3”项下 RAECs 的 96 孔板，加入 5 μmol/L 线粒
          除菌后，分装后置于－80 ℃冰箱，备用。                               体超氧化物红色荧光探针工作液，于室温避光孵育 30
          2.2 天麻芎苓止眩片含药血清最佳干预浓度筛选                            min，用 PBS 洗涤 5 次，加入 1∶800 浓度的 Hoechst33342
                                                             工作液，再于室温避光孵育20 min后，用PBS洗涤3次；
              取对数生长期的 RAECs，以胰酶消化，细胞稀释至
                                                             使用激光共聚焦显微镜于 510 nm激发波长处标记线粒
               5
          1×10 个/mL，以每孔100 μL接种至96孔板中。细胞分
                                                             体活性氧（红色），于350 nm激发波长处标记细胞核（蓝
          为 6 组，分别为正常组、模型组和 5%、10%、15%、20% 含
                                                             色），拍摄荧光图像，通过 Image J 1.53 软件分析细胞质
          药血清组，每组设4个复孔。除正常组外，其余各组分别
                                                             区域内的平均荧光强度，用以反映线粒体活性氧水平。
          加入 10 μg/mL 的 LPS 干预 24ｈ，建立 RAECs 炎症损伤
                                                             2.8 线粒体膜电位检测
          模型。各组分别给予“2.1”项下空白组血清（正常组、模
                                                                 取“2.3”项下RAECs的96孔板，加入10 μg/mL线粒
          型组）和相应浓度含药血清进行干预，24 h 后，按每孔
                                                             体膜电位荧光探针工作液，于37 ℃避光孵育45 min，用
          5 000 个细胞接种至 96 孔细胞培养板中培养 24 h 后，每
                                                             PBS 洗 3 次；采用激光共聚焦显微镜分别于 585 nm 和
          孔加入含 20 μL CCK-8 工作液的新鲜完全培养基 200
                                                             514 nm激发波长处进行荧光检测并拍照，绿色荧光为受
          μL，继续孵育2～3 h，采用多功能酶标仪于450 nm波长
                                                             损的线粒体膜电位，红色荧光为正常的线粒体膜电位，
          处检测各孔吸光度（A）值，计算细胞存活率：细胞存活
                                                             并以红绿荧光强度的比值反映线粒体膜电位的变化
          率（%）＝（A 中药组－A 正常组 ）/（A 模型组－A 正常组 ）×100%。
                                                             情况。
          2.3 分组、造模与给药
                                                             2.9 PINK1/Parkin信号通路相关蛋白检测
              待 RAECs 生 长 至 70%～80% 融 合 程 度 时 ，加 入
                                                                 采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的
          0.25%胰蛋白酶，离心、重悬细胞后，以每孔5 000个细胞
                                                             RAECs，按“2.3”项下方法分组、造模、给药，24 h后弃液，
          接种至96孔细胞培养板中，置于CO2细胞培养液中培养
                                                             加入细胞蛋白裂解液，于冰上裂解4 h，以12 000 r/min离
          24 h。次日吸去全部旧培养基，补充足量新鲜完全培养
                                                             心15 min；取上清，提取总蛋白，将蛋白与上样缓冲液混
          基，将细胞随机分为正常组、模型组、空白血清组、中药
                                                             匀、变性后，经电泳、转膜、封闭，加入 PINK1、Parkin、
          含药血清组、自噬阻断剂组、自噬激动剂组、中药联合自                          p62、LC3蛋白一抗（稀释度均为1∶800），4 ℃孵育过夜，
          噬激动剂组，每组设4个复孔。除正常组外，其余各组分                          加入 HRP 标记的二抗（稀释度为 1∶5 000），室温振摇孵
          别加入 10 μg/mL 的 LPS 干预 24ｈ，建立 RAECs 炎症损             育 1 h。采用 ECL 化学发光及蛋白成像分析系统扫描，
          伤模型，并以细胞形态学、细胞活力、炎症因子水平提示                          采用 Image J 1.53 软件分析，以目的蛋白与内参蛋白
          造模成功与否。空白血清组加入10%空白血清，中药含                         （β-actin）的灰度值比值表示目标蛋白的相对表达量。上
          药血清组加入10%天麻芎苓止眩片含药血清，自噬阻断                          述实验重复3次。
          剂组加入 20 μmol/L PD98059 ，自噬激动剂组加入 50                2.10 统计学方法
                                   [9]
                        [10]
          μmol/L Honokiol ，中药联合自噬激动剂组加入10%天                      采用SPSS 27.0软件进行统计分析。计量资料满足
          麻芎苓止眩片含药血清和50 μmol/L Honokiol。以上各                  正态分布，以 x±s 表示，方差齐性时多组间比较采用方
          组均继续干预 24 h 后，收集细胞样本，用于后续各项指                       差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；方差不齐时多
          标检测。                                               组间比较采用非参数Kruskal-Wallis H检验，进一步两两
          2.4 RAECs形态学观察                                     比较采用Mann-Whitney U检验。检验水准α＝0.05。
              取对数生长期的 RAECs，以每孔 5 000 个接种至 96                3 结果
          孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养 24 h 后，按                        3.1 不同浓度含药血清对RAECs活力的影响
         “2.3”项下方法分组、造模、给药，采用细胞成像分析系统                            与正常组[（100.00±6.82）%]比较，模型组细胞存活
          观察各组RAECs的形态及结构变化。                                 率[（67.05±4.58）%]显著降低（P＜0.01），提示 LPS 诱导


          中国药房  2025年第36卷第14期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 14    · 1739 ·
   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62