Page 60 - 《中国药房》2025年13期
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2 方法                                                脾脏组织适量，置于细胞筛中研磨组织，得单细胞悬液，
          2.1 HSH的制备                                          经无菌 PBS 洗涤 2 次后，重悬细胞；加入 LAC 缓冲液培
              取黑沙蒿 20 kg，用 95% 乙醇回流提取 2 次，每次 6                养4 h，以激活淋巴细胞，待测。取上述两种细胞样品适
          h，回收乙醇，得到乙醇提取物；利用硅胶色谱柱分离乙                           量，分别加入不含EDTA的胰酶进行消化，然后用冷PBS
          醇提取物，先用石油醚-乙酸乙酯溶液（80∶1，V/V）脱脂                       冲洗细胞，加入抗体 CD3、CD4、CD8a、CD25 的混合物，
          后，再用甲醇洗脱，合并洗脱液，回收溶剂后得到 HSH                          于 4 ℃避光孵育 30 min；固定破膜后，加入细胞内抗体
                      [7]
         （得率为0.2%） 。                                          IFN-γ、IL-17A、Foxp3，室温避光染色30 min；采用流式细
          2.2 分组、造模、给药及取材                                     胞仪测定全血及脾脏组织中Th1、Th17、Treg细胞水平。
              将大鼠适应性饲养 1 周后，选取 60 只大鼠，使用随                     2.7  大 鼠 踝 关 节 滑 膜 中 LCK、Fyn、ZAP70、CD45、
          机数字表法分为6组，分别为正常组、模型组和HSH低、                          RORγt、Foxp3蛋白表达检测
                                        [8]
          中、高剂量组（2.7、10.8、21.6 mg/kg ）以及阳性对照组                     取各组大鼠踝关节的滑膜组织适量，经裂解后提取
         （雷公藤多苷片，6.3 mg/kg，剂量根据临床等效剂量换                        总蛋白。将蛋白变性处理后，进行十二烷基硫酸钠-聚
          算），每组10只。除正常组外，对其余各组大鼠腹腔注射                          丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白转移到 PVDF 膜上，以 5%
          戊巴比妥（35 mg/kg）麻醉后，于大鼠左后足跖趾垫处一                       脱脂乳密封，在室温下放置1 h；加入LCK、Fyn、ZAP70、
                                          [9]
          次性注射完全弗氏佐剂，每只0.15 mL ，以诱导RA大鼠                       CD45、RORγt、Foxp3、GAPDH（稀释度均为 1∶3 000）孵
          模型。正常组大鼠在相同部位注射等体积生理盐水。3                            育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释度为1∶5 000）孵育
          d后观察造模大鼠左后足踝关节红肿情况，若明显肿胀，                           2 h；再次洗膜后，采用化学发光试剂盒显影，采用Image J
                      [10]
          提示造模成功 。各组大鼠灌胃相应药物或生理盐水，                            软件分析蛋白条带，以目的蛋白与内参 GAPDH 的灰度
          每天1次，连续28 d。                                        值比值表示目的蛋白的表达水平。
              末次给药 24 h 后，通过腹腔注射戊巴比妥麻醉大                       2.8  大 鼠 踝 关 节 滑 膜 中 LCK、Fyn、ZAP70、CD45、
          鼠，收集其腹主动脉血，取部分腹主动脉血制备血清，置                           RORγt、Foxp3 mRNA表达检测
          于－80 ℃冰箱中保存备用。另取腹主动脉血适量，置于                              采用 TRIzol 试剂提取各组大鼠踝关节的滑膜组织
          肝素锂抗凝管中，备用。取血完成后，处死各组大鼠，以                           总 RNA，然后逆转录为 cDNA；以 cDNA 为模板进行
          2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）灌洗其踝关节，经离心处理后                        PCR 扩增。扩增条件为 95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性
          即得关节液；剖取脾脏、踝关节组织保存备用。                               5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。以GAPDH为内参，采用
          2.3 大鼠踝关节肿胀度及关节炎指数检测                                2 －ΔΔCt 方法计算各目的基因的表达水平。引物序列和扩
              在造模前及给药后第1、7、14、21、28天，分别测定各                    增产物长度见表1。
                                             [11]
          组大鼠踝关节容积以计算踝关节肿胀度 ，同时采用 5                                     表1 引物序列和扩增产物长度
          级评分法对大鼠左后足的关节炎程度进行主观评分，记                            引物名称          引物序列（5′→3′）             扩增产物长度/bp
                                                              LCK           正向：CTCGTCCGGCTTTATGCAGT      85
                        [12]
          录为关节炎指数 。
                                                                            反向：GGAAATCTACTAGGCTCCCGTT
          2.4 大鼠踝关节组织病理形态学观察                                  Fyn           正向：ATTGGCCCGGATTGAAG       266
                                                                            反向：TGAGCTCGTGCAGGGAGA
              取各组大鼠踝关节组织适量，以 4% 多聚甲醛固定
                                                              Foxp3         正向：AGCCTGCCTCAGACAAGAAC    202
          24 h，经脱水包埋后切片；然后进行苏木素-伊红（HE）染                                     反向：GAAGAAGAGGAGGTGTGGGC
          色，经中性树胶封片后，采用显微镜观察大鼠踝关节组                            RORγt         正向：GTGCAATGTGGCCTACTCCT    164
                                                                            反向：GCAGACTGTCCCTCTGCTTC
          织病理形态学特征。
                                                              ZAP70         正向：GAGTGTCCGCCCGAAATGTA    150
          2.5 大鼠血清和关节液中炎症因子水平检测                                             反向：CTGTTCACACTGTGGGGGTC
                                                              CD45          正向：GGGCTGAGCCAGCATCTAAA    190
              取各组大鼠血清和关节液样品适量，按照试剂盒说
                                                                            反向：TCCTTAGCAGGGCCATTTCG
          明书方法处理，采用流式细胞微球阵列法检测大鼠血清                            GAPDH         正向：TGATGGGTGTGAACCACGAG    152
          和关节液中 IL-1β、IL-21、IL-17A、IL-2、IFN-γ 和 IL-6                        反向：AGTGATGGCATGGACTGTGG
          水平。                                                 2.9 统计学方法
          2.6 大鼠全血及脾脏中Th1、Th17、Treg细胞水平检测                         采用 GraphPad Prism 8.0.2 软件进行统计分析。数
              取各组大鼠全血样品，经 Ficoll 分离液分离外周血                     据均符合正态分布，以x±s表示。多组间比较采用单因
          单个核细胞，用无菌PBS洗涤2次，重悬细胞；加入LAC                         素方差分析，组间两两比较采用Tukey’s HSD检验。检
          缓冲液培养4 h，以激活淋巴细胞，待测。另取各组大鼠                          验水准α＝0.05。


          · 1606 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 13                            中国药房  2025年第36卷第13期
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