Page 31 - 《中国药房》2025年13期
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2.2.8 肺组织中TNF-α、IL-13、MALAT1、IFN-γ、TRPM2           件同大鼠实验。自实验第2天开始，各组小鼠开始给药，
          mRNA表达检测                                           每天 1 次，连续 21 d。小青龙汤给药组小鼠灌胃小青龙
              取“2.2.2”项下冻存的肺组织 30 mg（每组随机选 3                 汤冻干粉4.28 g/kg（根据人和动物体表面积折算的等效
          只大鼠的肺组织），采用Trizol试剂提取组织中总RNA，                      剂量），模型组小鼠灌胃等体积生理盐水。
          测定总 RNA 的纯度和浓度。按照逆转录试剂盒的要                          2.3.2 样本取材及处理
          求，将其逆转录为cDNA模板并进行PCR扩增。扩增体                             末次给药后，对小鼠禁食不禁水 12 h 后麻醉，摘眼
          系（总体积20 μL）为：2×SYBR Green qPCR Master Mix          球取血。将血样于室温静置2 h，然后以3 500 r/min离心
          10 μL，上、下游引物各 0.4 μL，cDNA 模板 4 μL，Water            15 min，取上清液，置于－80 ℃冰箱中暂存。脱颈椎处
          Nuclease-Free 5.2 μL。扩增条件为：95 ℃预变性 30 s；           死小鼠，取其肺组织置于－80 ℃冰箱中保存。
          95 ℃变性 10 s，60 ℃退火 30 s，40 个循环。以 GAPDH             2.3.3 指标检测
          为内参，采用 2    －ΔΔCt 法计算目标基因的 mRNA 相对表达                   每组随机选 5 只小鼠的血清，按“2.2.5”项下方法测
          水平。引物序列及扩增产物大小见表1。                                 定血清中SOD活力、MDA含量，按“2.2.6”项下方法测定
                  表1 大鼠引物序列及扩增产物大小                           血清中TNF-α、IL-13、IFN-γ水平。在野生小青龙汤组、
          基因             序列（5′→3′）               产物长度/bp     MALAT1 （－/－） 模型组、MALAT1  （－/－） 小青龙汤组中各取3只
          TNF-α          F：CCAGGTTCTCTTCAAGGGACAA    80      小鼠的肺组织，分别按照“2.2.8”“2.2.9”项下方法检测肺
                         R：GGTATGAAATGGCAAATCGGCT            组织中 TRPM2 mRNA 及其蛋白的表达水平（内参为
          IL-13          F：GCAACAGCAGCATGGTATGGAG  124
                         R：GCCATTCAATATCCTCTGGGTC            β-actin）。TRPM2的引物序列及扩增产物大小见表2。
          MALAT1         F：GGCTCCGCTGTGCTACATTA    107               表2 小鼠引物序列及扩增产物大小
                         R：TGTTTTGTTGGCCTTGGGGT
          IFN-γ          F：GGAACTGGCAAAAGGACGGT    130        基因           序列（5′→3′）                产物长度/bp
                         R：AGGTGCGATTCGATGACACTTA             TRPM2        F：AAGGGAACCTGACCTGCTTG       92
                                                                           R：CAGCGGAATCTCCACACCAT
          TRPM2          F：CCAATCTCCGACGAAGCAATA   203
                         R：AATGTGCTGCTCGTGGGTGTAA             β-actin      F：AGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG  139
          GAPDH          F：CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG  138                     R：ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC
                         R：GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT             2.4 统计学方法
          2.2.9 肺组织中TRPM2蛋白表达量检测                                 采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资
              取“2.2.2”项下冻存的肺组织 40 mg（每组随机选 3                 料均符合正态分布，以 x±s 表示，多组间比较采用单因
          只大鼠的肺组织），加入500 μL裂解液，提取组织中总蛋                       素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验；同组
          白，采用 BCA 试剂盒测定总蛋白浓度。将蛋白高温变                         间实验前后比较采用配对t检验。检验水准α＝0.05。
          性，然后上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电                           3 结果
          泳（在电压 70 V 下电泳 25 min，然后在电压 120 V 下电               3.1 大鼠实验结果
          泳40 min）分离，电泳结束后转移（电流300 mA，转膜时                    3.1.1 肺功能检测结果
          间100 min）至PVDF膜上，以5%脱脂奶粉室温封闭2 h；                       实验第 1 天（造模前），各组大鼠的各项肺功能指标
          TBST缓冲液洗膜3次、每次5 min，加入TRPM2一抗（稀                    差异均无统计学意义（P＞0.05）。与同组实验第 1 天以
          释比例1∶1 000），4 ℃孵育过夜；TBST缓冲液洗膜3次、                   及与实验第 22 天的空白组比较，实验第 22 天时模型组
          每次 5 min，加入二抗（稀释比例 1∶10 000），室温孵育 2                大 鼠 的 Raw 和 FRC 均 显 著 升 高（P＜0.01），PEF 和
          h；采用化学发光法显影，Image J软件分析蛋白条带灰度                      FEF50%均显著降低（P＜0.01），提示造模成功。实验第
          值，以TRPM2条带与内参（β-actin）条带灰度值的比值表                    22天时，与模型组比较，药物组大鼠的Raw和FRC均显
          示TRPM2蛋白的表达量。                                      著 降 低（P＜0.01），PEF 和 FEF50% 均 显 著 升 高（P＜
          2.3 小鼠实验                                           0.01）。结果见表3。
          2.3.1 分组、造模与给药                                     表3 各组大鼠实验第 1、22 天时的肺功能比较（x±s，
              将 20 只野生型 C57BL/6J 小鼠和繁殖好的 20 只                     n＝5）
          C57BL/6J MALAT1 （－/－） 小鼠分别按随机数字表法分为野                组别    Raw/[cmH 2O/（s·mL）]  FRC/mL  PEF/（mL/s）  FEF50%/（mL/s）
                                                                   实验第1天 实验第22天 实验第1天 实验第22天 实验第1天 实验第22天 实验第1天 实验第22天
          生 模 型 组 、野 生 小 青 龙 汤 组 、MALAT1     （－/－） 模 型 组 、    空白组  0.49±0.12 0.47±0.01  1.12±0.08 1.01±0.15 25.14±0.81 25.33±0.86 20.75±0.84 21.34±1.02
                                                                                       ab
                                                                                                  ab
          MALAT1 （－/－） 小青龙汤组，每组各 10 只。各组小鼠在实                  模型组  0.50±0.02 1.37±0.05 ab  1.24±0.04 2.44±0.19 24.25±0.10 17.38±0.72 19.86±0.67 14.30±0.51 ab
                                                              地塞米松组 0.50±0.01 0.29±0.02 c  1.11±0.08 1.64±0.10 23.67±1.36 19.94±0.50 21.59±1.37 18.87±0.54 c
                                                                                                  c
                                                                                       c
          验前同步适应性饲养1周，确保环境与条件一致。参照
                                                                                       c
                                                                                                  c
                                                              小青龙汤组 0.45±0.01 0.44±0.01 c  1.06±0.08 1.23±0.04 23.59±1.20 21.81±1.24 19.10±0.91 18.18±0.06  c
         “2.2.1”项下方法进行哮喘和寒饮蕴肺证造模，对小鼠注
                                                                a：与同组实验第1天比较，P＜0.01；b：与实验第22天的空白组比
          射0.2 mL抗原液，于0 ℃恒温冰箱中冷处理2 h，其他条                     较，P＜0.01；c：与实验第22天的模型组比较，P＜0.01。
          中国药房  2025年第36卷第13期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 13    · 1577 ·
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