Page 30 - 《中国药房》2025年13期
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leukin-13，IL-13 ）ELISA 试剂盒、兔源瞬时受体电位 M2              其余时间内，造模大鼠雾化后每天置于0 ℃恒温冰箱中
          型（transient receptor potential melastatin 2，TRPM2）多抗  冷处理3 h，同时给予24 h冰水混合物喂养，进行“形寒”
         （武 汉 博 士 德 生 物 工 程 有 限 公 司 ，批 号 分 别 为                与“饮冷”的刺激。
          54517261228、A01013-1），超氧化物歧化酶（superoxide                自实验第 2 天开始，各组大鼠开始给药，每天 1 次，
          dismutase，SOD）（WST-1 法）、丙二醛（malondialdehyde，        连续 21 d。小青龙汤组大鼠灌胃小青龙汤冻干粉 2.72
          MDA）（TBA 法）测定试剂盒（南京建成生物工程研究                         g/kg（根据人和动物体表面积折算的等效剂量）；阳性对
          所，批号分别为 A001-3-2、A003-1-1），lncRNA MALAT1            照组大鼠灌胃地塞米松 1 mg/kg（参考前期预实验结果
          ELISA 试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司 ，批号                          和文献设置     [14―15] ），空白组和模型组大鼠灌胃等体积生
          202301）。                                            理盐水。
          1.3 实验动物                                            2.2.2 动物取材及处理
              40 只雄性 6 周龄 SPF 级 Wistar 大鼠（体重 190～210              末次给药后，大鼠禁食不禁水12 h，麻醉大鼠，腹主
          g）和20只雄性8周龄SPF级野生型C57BL/6J小鼠（体重                     动脉取血，室温静置 2 h，将血样以 3 500 r/min 离心 15
          18～20 g）均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，                        min，取上清液，置于－80 ℃冰箱中暂存。取血结束后，
          动物生产许可证号为SCXK（京）2016-0006；4只（雌雄各
                                                              用颈椎脱臼法处死大鼠，取其左下叶肺组织固定在 4%
          半）SPF 级 C57BL/6J MALAT1  （－/－） 小鼠购自赛业（固安）
                                                              多聚甲醛中，其余肺组织置于－80 ℃冰箱中保存。
          生物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK（冀）2021-
                                                              2.2.3 肺功能检测
          003。动物购入后，于山东中医药大学动物实验中心饲
                                                                  分别在实验第 1 天开始前和第 22 天给药后 1 h，每
          养、繁殖；动物房昼夜 12 h 光/12 h 暗交替，相对湿度为
                                                              组随机选取5只大鼠，应用动物肺功能无创气道机制检
          40%～60%，温度为 20～25 ℃，饲养期间使其自由摄食
                                                              测系统对大鼠肺功能进行检测，具体指标包括：气道阻
          和饮水。动物的使用与操作均符合山东中医药大学实
                                                              力（airway resistance，Raw）、功能残气量（functional re‐
          验动物福利伦理审查委员会关于实验动物操作与动物
                                                              sidual capacity，FRC）、呼气流峰值（peak expiratory flow，
          福利的要求，且本研究通过了该委员会伦理审核，伦理
                                                              PEF）和呼气中期流速（forced expiratory flow at 50% of
          编号：SDUTCM20210917001、SDUTCM20231007001。
                                                              forced vital capacity，FEF50%）。
          2 方法
                                                              2.2.4 肺组织病理形态学观察
          2.1 药液制备
                                                                  取“2.2.2”项下固定于 4% 多聚甲醛中的肺组织（每
              小青龙汤冻干粉的制备与含量测定参照本课题组
                        [11]
          前期发表的方法 。参照《方剂学》（第5版）确定小青龙                          组随机选取 3 只大鼠的肺组织），制备石蜡切片（厚度 3
                                                              μm），常规进行 HE、Masson 染色，制片后置于显微镜下
          汤的煎煮剂量：麻黄 9 g，白芍 9 g，干姜 3 g，炙甘草 6 g，
                                                              检查，采集图像并观察大鼠肺组织气道结构、炎症浸润
          桂枝 6 g，五味子 3 g，半夏 9 g，细辛 9 g。具体煎煮方式
                                                              及胶原纤维沉积情况。应用Image J软件对Masson染色
          如下：称取麻黄 9 g，加 432 mL 水浸泡 30 min，以武火煎
                                                              照片中纤维化（阳性染色呈蓝色）面积进行测算，计算纤
          煮微沸后改用文火煎煮 20 min；按处方量称取其余药
                                                              维化百分比[纤维化百分比＝纤维化染色面积/总面积×
          材，加 432 mL 水浸泡 30 min 后，加入到上述麻黄煎液
                                                              100%]。
          中，以武火煎沸后用文火煎煮 40 min，将煎煮液过滤获
          得滤液，药渣再加342 mL水煎煮40 min后过滤。将2次                      2.2.5 血清中SOD活力和MDA含量测定
          滤液合并，减压浓缩，冻干，称质量（得率为 14.26%），保                          取“2.2.2”项下冻存的血清（每组随机选取 3 只大鼠
          存于干燥器中，备用。                                          的血清），常规解冻后，按 ELISA 试剂盒说明书的步骤，
          2.2 大鼠实验                                            测定各组大鼠血清中SOD活力和MDA含量。
          2.2.1 分组、造模与给药                                      2.2.6 血清中TNF-α、IL-13、IFN-γ水平检测
              将 40 只大鼠按照随机数字表法分为空白组、模型                            取“2.2.2”项下冻存的血清（每组随机选取 3 只大鼠
          组、地塞米松组（阳性对照）和小青龙汤组，每组 10 只。                        的血清），常规解冻后，按照试剂盒说明书方法测定血清
          将大鼠适应性饲养 1 周后，根据本课题组前期造模方                           中炎症因子TNF-α、IL-13、IFN-γ的水平。
          法 [12―13] 并改进后进行造模：（1）哮喘造模——除空白组                    2.2.7 肺组织中MALAT1表达量检测
          外，其余各组大鼠均在实验第1、8天腹腔注射1 mL抗原                             取“2.2.2”项下冻存的肺组织1 g（每组随机选3只大
          液（含卵清蛋白100 mg+氢氧化铝100 mg）；从实验第15                    鼠的肺组织），加入 9 mL 磷酸盐缓冲液制备组织匀浆，
          天开始，用 1% 卵清蛋白雾化激发，每天 30 min，持续 8                    将组织匀浆以3 000 r/min离心20 min，收集上清液。按
          d，以建立哮喘模型。空白组大鼠用生理盐水代替进行                            照试剂盒说明书操作，测定大鼠肺组织中 MALAT1 表
          相应处理。（2）寒饮蕴肺证造模——除实验第 1、8 天外，                       达量。


          · 1576 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 13                            中国药房  2025年第36卷第13期
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