Page 22 - 《中国药房》2025年12期
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2 方法                                                使用酶标仪于特定波长下测定各孔细胞的光密度（OD）
          2.1 原代心肌细胞分离、培养和鉴定                                  值，并按照说明书中的公式分别计算 FFA、CoA、acetyl-
              取新生 SD 大鼠数只，分离其心室部分并修剪成大                        CoA的含量。
          小约 1 mm 的组织块，加入 0.25% 胰蛋白酶和 0.2%Ⅱ型                  2.6 细胞糖酵解相关因子表达检测
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          胶原酶，经不锈钢网（200目）过滤后，以1 200 r/min离心                       采用 Western blot 法检测各组细胞中相关蛋白的表
          5 min，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基重悬并接种                    达。按“2.2”项下方法分组（每组各 3 个复孔）、造模、给
          于培养瓶中，采用差速贴壁法去除成纤维细胞（每天观                            药。收集各组细胞，加入含苯甲基磺酰氟的高效 RIPA
          察细胞状态，待细胞生长至80%时进行传代，每2 d更换                         裂解液适量，充分裂解，并于4 ℃下以12 000 r/min离心
          1 次培养液）。取培养 72 h 的单层细胞，转移至玻片上，                      5 min，收集上清液，以BCA法测定蛋白浓度后进行变性
          用4%甲醛溶液固定20 min后，用含0.1%Triton X-100免                处理。取变性蛋白适量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯
          疫染色通透液的磷酸盐缓冲液（PBS）渗透 10 min，再用                      酰胺凝胶电泳分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜上，以封
          含牛血清白蛋白的PBS封闭非特异性结合位点30 min；                        闭 液 于 室 温 下 振 摇 封 闭 2  h；洗 膜 后 ，加 入 HIF-1α、
          加入 cTnT 一抗（稀释度 1∶100），于 4 ℃下孵育过夜；以                  GLUT-4、LDHA、PDK1、PFKFB3、α-tubulin一抗（稀释度
          PBS 洗涤后，用藻红蛋白标记的相应二抗（稀释度 1∶                         分别为 1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶
          200）孵育1 h；使用含抗荧光淬灭剂的封片液封片后，再                        5 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释
          使用荧光显微镜观察、鉴定（心肌细胞具有特异性的                             度均为 1∶10 000），于室温下振摇孵育 1 h；洗膜后，以
          cTnT荧光信号）。                                          ECL发光液显色、曝光、成像。使用Image J软件分析各
          2.2 分组、造模与给药                                        蛋白的灰度值，以各目的蛋白与内参蛋白（α-tubulin）的
              取“2.1”项下处于对数生长期的原代心肌细胞，将其                       灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。
          分为对照组（C 组）、AngⅡ组（M 组）、TSG 组（T 组）、                       采用实时聚合酶链式反应（real-time PCR，RT-PCR）
          PFK-015 组（P 组）、TSG+PFK-015 组（T+P 组）。C 组细            法检测各组细胞中相关因子 mRNA 的表达情况。收集
          胞不作任何处理，其余各组细胞均加入终浓度为2 µmol/L                       上述各组细胞，加入 TRIzol 试剂以提取细胞总 RNA。
          的AngⅡ（诱导浓度根据预实验结果设置），各药物组细                          待测定其浓度、纯度后，按相应试剂盒说明书方法将其
          胞再分别加入终浓度为7.5 µg/mL的TSG或/和10 nmol/L                 反转录为cDNA，并以此为模板进行PCR扩增。反应体
          的 PFK-015（干预浓度根据预实验结果设置），于 37 ℃、                    系（20 µL）包括 2×SYBR Green qPCR Master Mix（无
          5%CO2条件下培养24 h。                                     ROX染料）10 µL、正向/反向引物（具体序列及产物长度
          2.3 细胞表面积检测                                         见表 1）各 2 µL、cDNA 模板 1 µL、无核酶水 5 µL。反应
              按“2.2”项下方法分组（每组各 4 个复孔）、造模、给                    条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸
          药。收集各组细胞，用 4% 多聚甲醛溶液固定后再以                           30 s，共 40 个循环。以 α-tubulin 为内参，采用 2      －ΔΔCt 法计
          PBS 浸洗，使用 0.1%Triton X-100 免疫染色通透液于室                算目的基因的相对表达量，结果以C组为参照进行归一
          温下通透15 min；滴加5%正常血清，室温下封闭1 h；加                      化处理。
          入α-actin一抗（稀释度1∶200），4 ℃下孵育过夜；以PBS                            表1 引物序列及扩增产物长度
          浸洗 3 次，加入藻红蛋白标记的相应二抗（稀释度 1∶                         目的基因        序列（5′→3′）                 扩增产物长度/bp
                                                              HIF-1α      正向引物：AAGTCTAGGGATGCAGCACG    101
          200），37 ℃下孵育 1 h；加入 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚
                                                                          反向引物：AGATGGGAGCTCACGTTGTG
         （DAPI）染色试剂适量，避光孵育5 min；使用含抗荧光淬                       GLUT-4      正向引物：TGGAAAGAGAGCGTCCACTG    189
          灭剂的封片液封片后，再使用荧光显微镜观察并采集图                                        反向引物：CAGCTCCTATGGTGGCGTAG
                                                              LDHA        正向引物：CCTCAGCGTCCCATGTATCC    99
          像。采用Image-Pro Plus 6.0软件计算细胞表面积：细胞
                                                                          反向引物：TCTGCACTCTTCTTCAGGCG
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          表面积（μm /个）＝总阳性面积（呈红色荧光）/细胞总数。                       PDK1        正向引物：GTCGGAGAGCGGCGTT        144
          2.4 细胞蛋白合成检测                                                    反向引物：ACAGGCAACTCTTGTCGAAGAA
                                                              PFKFB3      正向引物：TTTGGAACTGACCCAGAGCC    124
              按“2.2”项下方法分组（每组各 8 个复孔）、造模、给
                                                                          反向引物：GAGCCCCACCATCACAATCA
          药。收集各组细胞，严格按照蛋白合成分析试剂盒说明                            α-tubulin   正向引物：CGCTGTAAGAAGCAACACCT    83
          书操作，使用酶标仪测定其相对荧光值，用以反映各组                                        反向引物：GGAGATACACTCACGCATGG
          细胞的蛋白合成情况（细胞相对荧光值越大，表明其蛋                            2.7 统计学方法
          白合成越异常增加，心肌细胞肥大性改变越明显）。                                 采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。实验数
          2.5 细胞能量代谢相关指标含量检测                                  据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一
              按“2.2”项下方法分组（每组各 3 个复孔）、造模、给                    步两两比较采用 LSD-t 检验（方差齐时）或 Dunnett’s T3
          药。收集各组细胞，严格按照相应试剂盒说明书操作，                            检验（方差不齐时）。检验水准α＝0.05。


          · 1432 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 12                            中国药房  2025年第36卷第12期
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