Page 60 - 《中国药房》2025年11期
P. 60

自武汉爱博泰克生物科技有限公司；胱天蛋白酶1抗体                            2.4 大鼠血脂、肝功能和炎症指标检测
         （caspase-1，批号22915-11AP）购自武汉三鹰生物技术有                      采用 ELISA 法检测大鼠血清中的 TG、TC、LDL-C、
          限公司。                                                HDL-C、ALT、AST、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平，所有
          1.3 主要仪器                                            试剂盒均严格按照试剂盒说明书操作。
              5810R型高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；                   2.5 大鼠肠道菌群16S rDNA测序及分析
          Milli-Q 型纯水仪购自德国默克密理博公司；Spark 10M                       使用DNA抽提试剂盒从“2.2”项下大鼠粪便样本中
                                             TM
          型酶标仪购自瑞士 Tecan 公司；Vanquish  Horizon 型超              提取肠道微生物 DNA，通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分析
          高效液相色谱系统、Q-Exactive HF-X 型质谱仪、Nano‐                 DNA 提取质量，并运用微量分光光度计检测 DNA 的浓
          Drop 型微量分光光度计、Qubit4.0 荧光计均购自美国                     度与纯度。对 16S rDNA 基因的 V1～V9 区进行 PCR 扩
          Thermo Fisher Scientific公司；JXDC-20型氮气吹扫仪购           增，使用2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，随后通过磁
          自上海净信实业发展有限公司；LNG-T88型台式快速离                         珠法进行纯化处理。纯化后的样品采用 Qubit 4.0 荧光
          心浓缩干燥器购自太仓市华美生化仪器厂；Wonbio-96C                       计进行浓度测定和定量分析。使用 PICRUSt2（2.2.0 版
          型多样品冷冻研磨仪购自上海万柏生物科技有限公司；                            本）软件进行测序。高通量测序由上海美吉生物医药科
          MS105DU型电子天平购自瑞士Mettler Toledo公司。                   技有限公司完成。随后，利用 Majorbio 云平台（https：//
          2 方法                                                cloud.majorbio.com）进行物种注释 α 多样性分析（包括
          2.1 分组、造模与给药                                        Simpson 指数、Shannon 指数和 Chao1 指数）、β 多样性分
              所有大鼠适应性喂养7 d后，随机取7只大鼠为正常                        析[主成分分析（principal component analysis，PCA）]、物
          组，喂食普通饲料；其余25只大鼠为造模组，喂食高脂饲                          种组成（门、属水平）差异分析等生物信息学分析。以相
          料构建NAFLD大鼠模型。造模6周后，与正常组比较，                          对丰度作为生物多样性分析的检测指标。
          造模组大鼠体重显著升高（P＜0.01）；取 1 只正常组大                       2.6 大鼠粪便代谢组学分析
          鼠肝脏观察其表面呈红褐色，同时取1只造模大鼠观察                            2.6.1 粪便样本处理
          其肝脏外观呈弥漫性肿大，表面呈明显灰黄色色泽，有                                取“2.2”项下粪便样本，将50 mg粪便样本置于2 mL
                                              [12]
          油腻感，表明 NAFLD 大鼠模型构建成功 。将造模成                         离心管中，加入研磨珠。400 μL提取液（甲醇、水体积比
          功的大鼠随机分为模型组、阿托伐他汀组（阳性对照，给                           为 4∶1）含 0.02 mg/mL 的内标（L-2-氯苯丙氨酸）进行代
          药剂量 2 mg/kg）、金刚藤胶囊低剂量组（给药剂量 0.63                    谢产物提取。样本溶液于冷冻组织研磨仪研磨 6 min
          mg/kg，相当于金刚藤胶囊临床剂量）、金刚藤胶囊高剂                        （－10 ℃，50 Hz），后低温超声提取 30 min（5 ℃，40
          量组（给药剂量 2.52 mg/kg）组，剂量根据金刚藤胶囊和                     kHz）。将样品静置于－20 ℃ 30 min，以 13 000×g 在
          阿托伐他汀的临床给药剂量结合大鼠体表面积折算。                             4 ℃离心 15 min，移取上清液至带内插管的进样小瓶中
          每组6只大鼠，采用灌胃给药的方法给予相应的药物，每                           上机分析。
          日 1 次，正常组和模型组大鼠每日灌胃生理盐水（10                          2.6.2 色谱与质谱条件
          mL/kg），连续灌胃6周。给药期间模型组及各给药组大                             色谱条件：色谱柱为 ACQUITY UPLC HSS T3 （100
          鼠继续喂食高脂饲料。                                          mm×2.1 mm，1.8 µm）；流动相A为95%水+5%乙腈（含
          2.2 样本采集                                            0.1%甲酸），流动相B为47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水
              于末次给药后 1 h，收集正常组、模型组、金刚藤胶                      （含 0.1% 甲酸），梯度洗脱（正离子：0～3 min，100%A→
          囊高剂量组（仅选择药效最好的高剂量组）大鼠粪便，置                           20%B；3～4.5 min，20%B→35%B；4.5～5 min，35%B→
          于2 mL干燥灭菌的离心管中，于－80 ℃冰箱中保存，进                        100%B；5～6.3 min，100%B；6.3～6.4 min，100%B→0B；
          行16S rDNA测序和代谢组学研究。末次给药后各组大                         6.4～8 min，100%A。负离子：0～1.5 min，100%A→5%B；
          鼠禁食不禁水12 h，次日腹腔注射2%戊巴比妥麻醉后，                         1.5～2  min，5%B→10%B；2～4.5  min，10%B→30%B；
          腹主动脉取血，以 3 000 r/min 离心 10 min，分离上层血                4.5～5  min，30%B→100%B；5～6.3  min，100%B；6.3～
          清。取血后于冰盘上取出肝脏组织，将部分左侧肝小叶                            6.4 min，100%B→100%A；6.4～8 min，100%A）；进样量
          固定于4%多聚甲醛溶液中，其余大鼠肝脏组织及血清保                           为 3 μL；柱温为 40 ℃。质谱条件：样品经电喷雾电离，
          存于－80 ℃冰箱中，用于后续检测。                                  分别采用正、负离子扫描模式采集质谱信号；详细参
          2.3 大鼠肝脏病理组织形态观察                                    数为鞘气流量50 arb，辅助气体流量13 arb，毛细管温度
              取“2.2”项下固定的大鼠肝脏组织，采用 HE 染色、                     325 ℃，一级质谱分辨率 60 000 Da，二级质谱分辨率
          油红O染色，置于显微镜下观察大鼠肝脏组织的病理形                            7 500 Da，碰撞能量 20/40/60 eV，正离子模式喷雾电压
          态变化，并拍照。                                            3 500 V，负离子模式喷雾电压－3 500 V。


          · 1342 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 11                            中国药房  2025年第36卷第11期
   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65