Page 47 - 《中国药房》2025年10期
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注射10 mg/kg的HIF-1α拮抗剂2-ME（1%二甲基亚砜溶                  室温下用 10% 山羊血清封闭 1 h；加入 NLRP3、Iba-1 一
             [14]
          解） 并灌胃等体积生理盐水，安石榴苷组大鼠灌胃300                         抗（稀释比例均为1∶100），4 ℃下孵育过夜；加入荧光标
                                       [11]
          mg/kg的安石榴苷（生理盐水溶解） 并腹腔注射等体积                        记的相应二抗（稀释比例均为 1∶200），室温下孵育 2 h；
          1%二甲基亚砜；安石榴苷+DMOG组大鼠灌胃300 mg/kg                    加入 DAPI 染液，于室温下染核 8 min；以中性树脂封片
          的安石榴苷并腹腔注射 175 mg/kg 的 HIF-1α 激动剂                  后 ，使 用 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 并 使 用 Image  J 软 件 对
                                                                                                   +
                                                                                              +
                                   [14]
          DMOG（1% 二甲基亚砜溶解） ；NP 组和假手术组均灌                      NLRP3和Iba-1共染色细胞（即NLRP3 /Iba-1 细胞，呈黄
          胃等体积生理盐水并腹腔注射等体积 1% 二甲基亚砜。                         绿色）进行计数，用以表示大鼠脊髓背角小胶质细胞中
          每天1次，连续14 d。                                       NLRP3的阳性表达情况。
          2.2 疼痛行为学评估                                        2.7 脊髓组织中 HIF-1α、NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白
              于末次给药 12 h 后，以机械痛测定仪测定各组的                      表达检测
          MWT：将大鼠单独置于金属网笼中适应30 min，然后用                           采用Western blot实验检测。取各组剩余6只大鼠，
          校准的Von Frey刺激针从网笼下方刺激其左侧足底，记                       按“2.3”项下方法处死后，分离其 L4～L6 脊髓组织，用
          录大鼠缩足时的刺激强度，即为 MWT。以红外辐射热                          RIPA 裂解缓冲液提取其总蛋白，用 BCA 法检测蛋白浓
          法测定各组大鼠的热缩足反射潜伏期（thermal with‐                     度后，于金属浴中加热变性。取变性蛋白适量，进行
          drawal latency，TWL）：上述机械痛实验结束后，将大鼠                 12.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转
          置于有机玻璃笼中适应30 min，然后用热痛刺激仪垂直                        移到聚偏二氟乙烯膜上，用 5% 脱脂牛奶于室温下封闭
          照射大鼠后肢足底，若大鼠出现舔舐和（或）抬足，立即                          2  h；洗 膜 后 ，加 入 HIF-1α、NLRP3、ASC、caspase-1、
          停止照射并记录所用照射时间，即为TWL。上述疼痛行                          GAPDH一抗（稀释比例分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、
          为指标（MWT 和 TWL）的检测均在上午 09：00－12：00                  1∶1 000、1∶2 000），于 4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相
          于安静的动物房内进行，每间隔10 min测量1次，重复3                       应二抗（稀释比例为 1∶4 000），于室温下孵育 1 h；洗膜
                                                             后，加入 ECL 试剂显影，于凝胶成像仪下成像。使用
          次取平均值。
                                                             Image J 软件，以 GAPDH 为内参，用各目的蛋白与内参
          2.3 脊髓组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平检测
                                                             蛋白的灰度值比值表示各目的蛋白的表达水平。
              疼痛行为学评估完成后，随机选取每组6只大鼠，腹
                                                             2.8 统计学方法
          腔注射过量戊巴比妥钠（120 mg/kg）处死后，分离其
                                                                 采用 GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行统计分
          L4～L6 脊髓组织，加入预冷的磷酸盐缓冲液，研磨后，
                                                             析。实验数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差
          以12 000 r/min离心20 min，取上层清液，采用ELISA法
                                                             分析，进一步两两比较采用 Tukey 事后检验。检验水准
          以酶标仪检测其TNF-α、IL-1β、IL-6水平。
                                                             α＝0.05。
          2.4 脊髓背角形态学变化观察
                                                             3 结果
              随机选取每组另 6 只大鼠，按“2.3”项下方法处死
                                                             3.1 安石榴苷对大鼠疼痛行为学的影响
          后，分离其 L4～L6 脊髓组织，经 4% 多聚甲醛溶液固定
                                                                 与假手术组比较，NP 组大鼠的 MWT、TWL 均显著
          后，行常规石蜡包埋、切片（厚约5 μm）。取上述切片适
                                                             降低或缩短（P＜0.05）；与 NP 组比较，2-ME 组、安石榴
          量，经烤片、脱蜡、脱水、氧化、洗涤等操作后，在60 ℃水
                                                             苷组大鼠的 MWT、TWL 均显著升高或延长（P＜0.05）；
          浴中用六胺银试剂染色（当切片呈烟草样黄色或黑色时
                                                             与安石榴苷组比较，安石榴苷+DMOG 组大鼠的 MWT、
          停止染色，约 30 min）；清洗后，用 0.1% 氯化金溶液调色
                                                             TWL均显著降低或缩短（P＜0.05）。结果见表1。
          2 min；清洗后，用快绿溶液复染 1 min；经脱水、透明、封
                                                                 表1 各组大鼠MWT、TWL比较（x±s，n＝18）
          片后，使用光学显微镜观察脊髓背角的形态学变化。
                                                              组别                  MWT/g              TWL/s
          2.5 脊髓背角神经元凋亡检测
                                                              假手术组               23.40±2.52        15.65±1.60
              取“2.4”项下各组大鼠的脊髓组织石蜡切片适量，经                       NP组                8.96±1.47 a        4.73±0.89 a
          脱蜡和过氧化氢、蛋白酶 K 处理后，在避光条件下用                           2-ME组              17.15±2.04 b      12.40±1.35 b
                                                              安石榴苷组              16.84±1.95 b      11.93±1.28 b
          TUNEL 工作液孵育，然后用 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚
                                                              安石榴苷+DMOG组         10.72±1.80 c       7.00±0.94 c
         （DAPI）染液染核；经甘油封片后，使用荧光显微镜捕获                            a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与NP组比较，P＜0.05；c：与安石
          染色图像并观察脊髓背角中神经元凋亡情况（凋亡神经                           榴苷组比较，P＜0.05。
          元呈绿色），按下式计算凋亡率：凋亡率（%）＝凋亡神经                         3.2 安石榴苷对大鼠脊髓组织中炎症因子水平的影响
          元数/总细胞数×100%。                                          与假手术组比较，NP组大鼠脊髓组织中TNF-α、IL-
          2.6 脊髓背角小胶质细胞中NLRP3阳性表达检测                          1β、IL-6水平均显著升高（P＜0.05）；与NP组比较，2-ME
              取“2.4”项下各组大鼠的脊髓组织石蜡切片适量，经                      组、安石榴苷组大鼠脊髓组织中上述各炎症因子水平均
          脱蜡、水化后，用 0.2%Triton X-100 试剂孵育 10 min，于            显著降低（P＜0.05）；与安石榴苷组比较，安石榴苷+


          中国药房  2025年第36卷第10期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 10    · 1193 ·
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