Page 35 - 《中国药房》2025年10期
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养基。分别在培养 0、24、48、72 h 时，于各孔中加入                     2.3.2 DEGs富集分析
          CCK-8试剂10 μL，再于37 ℃下孵育2 h，使用酶标仪于                       将 DEGs 导入 Metascape 平台（http：//metascape.org/
          450 nm 波长处检测各孔的光密度（OD）值，计算细胞活                      gp/index.html），在“input as species”和“analysis as spe‐
          力[细胞活力（%）＝（实验组OD值－空白组OD值）/（对                       cies”项下选择“homo sapiens”，将最小重叠（mini over‐
          照组OD值－空白组OD值）×100%]，并绘制浓度-时间                       lap）设为 3（P＜0.01）、最小富集（mini enrichment）设为
          曲线。                                                1.5，进行基因本体（gene ontology，GO）、京都基因和基
          2.2.2 细胞克隆形成能力                                     因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，
              采用克隆形成实验检测。取对数生长期的KTC-1、                       KEGG）、维基代谢通路（WikiPathway）富集分析。
          TPC-1 细胞，分别以每孔 1 000 个接种于 6 孔板中，并按                 2.3.3 DEGs相关网络构建及核心靶点识别
         “2.2.1”项下方法分组（勿需设置空白组）、处理。培养                            将 DEGs 导 入 String 数 据 库（http：//cn. string-db.
          14 d 后，收集细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 3 次后，                   org），进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein inter‐
          用4%多聚甲醛溶液固定15 min，然后用0.1%结晶紫染                      action，PPI）网络分析（置信阈值≥0.4），并以 Cytoscape
          液染色10 min；将细胞洗涤、干燥后，使用倒置光学显微                       3.8.0软件进行可视化展示；随后，使用该软件的“cytoNCA”
          镜对各组细胞的克隆形成情况（将细胞数＞50个的集落
                                                             插件计算网络中各节点的介数中心度（betweenness cen‐
          记为 1 个克隆）进行观察，并使用 Image J 软件处理并计                                                           [11]
                                                             trality，BC），并由大到小排序，以识别核心靶点 。
          算克隆形成率[克隆形成率（%）＝克隆细胞数/接种细胞
                                                             2.3.4 核心靶点在THCA中的表达特征及预后分析
          数×100%]。
                                                                 借助 UALCAN 数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/
          2.2.3 细胞迁移能力
                                                             index.html）中的癌症基因组图谱（the Cancer Genome
              采用划痕实验检测。取对数生长期的KTC-1、TPC-1
                                                             Atlas，TCGA）模块，以癌旁正常甲状腺组织为参照，探
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          细胞，分别以每孔 1×10 个接种于 6 孔板中，培养，待细
                                                             索THCA组织中核心靶点mRNA的表达特征（以每百万
          胞融合至100%时，更换不含血清的培养基，并用移液器
                                                             转录本数表示）。
          枪头在各孔底部中央划一直线，用 PBS 清洗后，将细胞
                                                                 以 Nthy-ori 3-1 细胞为对照，采用 Western blot 法检
          按“2.2.1”项下方法分组（勿需设置空白组）、处理。分别
                                                             测核心靶点的表达，以比较正常甲状腺细胞与THCA细
          于培养 0、24 h 时使用倒置光学显微镜观察各组细胞的
                                                             胞中核心靶点蛋白的表达特征。具体操作如下：取对数
          划痕宽度，并使用 Image J 软件计算细胞迁移率[细胞迁
                                                             生长期的 Nthy-ori 3-1、KTC-1、TPC-1 细胞，分别以每孔
          移率（%）＝（0 h时划痕宽度－24 h时划痕宽度）/0 h时划
                                                             1×10 个接种于96孔板中，培养24 h；收集细胞，用PBS
                                                                  6
          痕宽度×100%]。
                                                             清洗后，加入 RIPA 裂解液裂解、提取总蛋白，经浓度检
          2.2.4 细胞侵袭能力
                                                             测后进行变性处理；取变性蛋白适量，进行 10% 十二烷
              采用Transwell实验检测。取对数生长期的KTC-1、
                                                             基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至聚偏二氟
          TPC-1 细胞，用不含血清的培养基重悬后，分别以每孔
                                                             乙烯膜上，于室温下以 5% 脱脂牛奶封闭 1 h；加入一抗
               5
          1×10 个接种于预先用基质胶处理的 Transwell 小室上
                                                            （核心靶点、β-actin 的稀释比例均为 1∶1 000），于 4 ℃下
          层；将含 10%FBS 的培养基置于小室下层；上层细胞按
                                                             孵育过夜；加入相应二抗（稀释比例为1∶1 000），于室温
         “2.2.1”项下方法分组（勿需设置空白组）、处理。培养
          24 h，收集穿膜细胞，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，再                    下孵育 2 h；洗膜后，以化学发光试剂显影，并于化学发
          用0.1%结晶紫染液染色10 min，使用倒置光学显微镜观                      光成像系统下成像，以β-actin为内参计算核心靶点的蛋
          察侵袭细胞（呈紫色）并使用Image J软件统计侵袭数。                       白表达水平。
          2.3 DEX 对 THCA 细胞恶性生物学行为影响的靶点                          采 用 Kaplan-Meier  Plotter 数 据 库（https：//kmplot.
          预测                                                 com/analysis/）分析 THCA 患者体内核心靶点表达与预
          2.3.1 差异表达基因分析                                     后关系。
              首先，使用RNeasy试剂盒从DEX（100 nmol/L）处理               2.4 DEX 对 THCA 细胞恶性生物学行为影响的靶点
          48 h或不处理的THCA细胞中分离总RNA（一式3份），                      验证
          利用 DNBSEQ 测序平台以微阵列技术进行全基因组测                        2.4.1 DEX对核心靶点mRNA及蛋白表达影响的检测
          序（由深圳华大基因科技有限公司完成）。根据全基因                               采用实时荧光定量 PCR（real-time quantitative fluo‐
          组测序结果，使用 R 4.3.0 软件的“Limma”包，以|log2变               rescence PCR，RT-qPCR）法检测核心靶点 mRNA 的表
                                                     [10]
          化倍数（fold change，FC）|＞2、校正 P＜0.05 为标准 筛             达。取对数生长期的 KTC-1、TPC-1 细胞，分别以每孔
                                                                  6
          选差异表达基因（differently expressed genes，DEGs）并         1×10 个接种于 96 孔板中，按“2.2.1”项下方法分组（勿
          绘制火山图。                                             需设置空白组）、处理、培养24 h。收集细胞，使用Trizol


          中国药房  2025年第36卷第10期                                              China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 10    · 1181 ·
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