Page 30 - 《中国药房》2025年9期
P. 30

01）均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；PCR 引                         －80 ℃下储存，备用。取血后处死小鼠，每组随机选取
          物由南宁捷尼斯生物科技有限公司设计并合成。                               7 只剥离其海马组织，并于－80 ℃下保存，用于实时荧
          1.3 动物                                              光定量PCR（每组3只）和Western blot检测（每组4只）；

              40 只 6 月龄 SPF 级雄性 APP/PS1 转基因 AD 小鼠             快速取出每组剩余 3 只小鼠的脑组织，并置于 4% 多聚
         （5XFAD 小鼠）及 10 只同背景、同月龄的雄性野生型                        甲醛中固定，常规石蜡包埋后切片（厚度约5 μm），用于
          C57BL/6J 小鼠均购自湖南斯莱克景达实验动物有限公                        苏木精-伊红（HE）染色及组织免疫荧光化学染色分析。
          司[动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004]。小鼠购                    2.5 小鼠海马组织病理形态学观察
          入后，饲养于广西中医药大学动物实验中心SPF级动物                               采用 HE 染色法观察。取“2.4”项下小鼠脑组织石
          房，该动物房符合 SPF 级医学实验动物环境及设施要                          蜡切片，经脱蜡、水洗后，行HE染色，显微镜下观察其海
          求。本研究动物实验获广西中医药大学科学实验中心                             马组织病理形态学变化并拍照，采集图像并分析。
          动 物 伦 理 委 员 会 审 核 通 过（伦 理 号 ：DW20220215-            2.6 小鼠血清中TNF-α、IL-4水平检测

          053-02）。                                                采用 ELISA 法检测。取“2.4”项下血清样品，室温
          2 方法                                                解冻，按照 ELISA 试剂盒说明书步骤操作，采用酶标仪
          2.1 温脾通络开窍方药液的制备                                    于450 nm波长处检测小鼠血清中TNF-α、IL-4水平。
              按温脾通络开窍方组成称取方中各饮片，置于烧瓶                          2.7 小鼠海马组织中 ZBP1/MLKL 信号通路相关蛋白
          中，加水2 000 mL，煎煮2 h×3次；过滤，合并3次滤液，                    表达检测
          于 45 ℃水浴中减压浓缩至 2.08 g/mL（以生药量计）；置                       采用Western blot法检测。取“2.4”项下各组冻存的
          于4 ℃下保存，备用。                                         小鼠海马组织适量，提取组织中总蛋白，测定总蛋白浓
          2.2 分组与给药                                           度后作变性处理，制备蛋白上样样品，随后进行电泳（电

              将 40 只 5XFAD 小鼠和 10 只 C57BL/6J 正常小鼠适            压 400 V，电泳时间 1 h）分离，并将分离的蛋白转移（电
          应性喂养 1 周。然后将 5XFAD 小鼠随机分为模型组                        流 400 mA，转膜时间 100 min）到 PVDF 膜上，在室温下
         （MOD 组），温脾通络开窍方低、高剂量组（WPTL-L 组、                      用 5% 脱脂牛奶封闭 2 h。加入 GAPDH、APP、p-Tau、
          WPTL-H组），盐酸多奈哌齐组（阳性对照，DH组），每组                       ZBP1、p-RIPK1、RIPK1、p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL、
          10 只；并将 10 只 C57BL/6J 小鼠作为正常对照组（NC                  MLKL一抗（稀释比例分别为1∶60 000、1∶500、1∶2 000、
          组）。WPTL-L组、WPTL-H组小鼠分别按10.4、20.8 g/kg               1∶500、1∶500、1∶500、1∶1 000、1∶500、1∶1 000、1∶500），
         （以生药量计，根据人与小鼠体表面积换算，分别为 1、2                          于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入相应二抗（稀释比例均
          倍临床等效剂量）灌胃温脾通络开窍方药液；DH组小鼠                           为 1∶10 000），于室温下孵育 1.5 h；洗膜后显影，成像。

          按 3 mg/kg 灌胃盐酸多奈哌齐（根据文献[8]及预实验结                     使用 Image J 软件分析各蛋白条带的灰度值，以 APP、p-
          果确定）；NC 组和 MOD 组小鼠灌胃等体积生理盐水。                        Tau、ZBP1 与内参蛋白（GAPDH）条带的灰度值比值表
          每天给药1次，连续30 d。                                      示 APP、p-Tau、ZBP1 蛋白的表达水平，以 p-RIPK1 与
          2.3 行为学检测                                           RIPK1、p-RIPK3 与 RIPK3、p-MLKL 与 MLKL 条带的灰
              末次给药 24 h 后进行水迷宫实验以评估小鼠的学                       度值比值表示 RIPK1、RIPK3 和 MLKL 蛋白的磷酸化
          习及空间记忆能力。将水迷宫划分为4个象限，平台置                            水平。
          于第三象限，注水没过平台。前5 d进行定位航行实验，                          2.8 小鼠海马组织神经元内p-RIPK3阳性表达检测
          分别将小鼠依次从4个象限放入，小鼠找到平台则停止                                采用免疫荧光染色法检测。取“2.4”项下小鼠脑组
          实验，记录每天的逃避潜伏期；若小鼠 60 s 内未找到平                        织切片，经脱水、漂洗、封闭后与 p-RIPK3 抗体（稀释比
          台，则引导其至平台并停留 10 s，逃避潜伏期按 60 s 计。                    例为 1∶100）孵育过夜，再使用羊抗兔 IgG（H+L）红色荧
          第 6 天进行空间探索实验，撤走平台记录每组小鼠 60 s                       光二抗（稀释比例为1∶200）进行孵育；用DAPI染色细胞

          内穿越平台次数。                                            核，室温下孵育5～10 min，以标记核位置。对样本进行
          2.4 样本制备                                            封片，并使用显微镜观察和成像。以红色荧光强度反映
              水迷宫实验结束后，小鼠经20%乌拉坦麻醉，腹主动                        p-RIPK3阳性表达水平高低，采用Image J软件对阳性表
          脉取血。血样以 3 000 r/min 离心 15 min，取上清液于                 达蛋白的荧光强度进行分析。


          · 1048 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 9                              中国药房  2025年第36卷第9期
   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35