Page 47 - 《中国药房》2025年7期
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          体以及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗、                           分别灌胃 3.06、6.12、12.24 g/（kg·d）枳壳甘草汤 ，分别
          Alexa Fluor488 标记的羊抗兔二抗、Alexa Fluor594 标记          为临床等效剂量的 0.5、1、2 倍；假手术组和模型组大鼠
          的羊抗兔二抗（批号分别为 11265-1-AP、17873-1-AP、                灌胃等体积生理盐水。各组大鼠的灌胃体积均为12.24
          28459-1-AP、 20960-1-AP、 10373-2-AP、 27306-1-AP、    mL/kg，每天给药1次，连续3周。
          27093-1-AP、 24613-1-AP、 SA00001-2、 19003-1-AP、     2.2.2 样本采集
          81640-5-RR、SA00013-2、SA00013-4）均购自武汉三鹰生                末次给药1 h后，使用3%戊巴比妥钠麻醉并处死大
          物技术有限公司；兔源血管内皮生长因子受体 2（vascu‐                      鼠，然后快速离断大鼠 Co5-9 节段尾椎，一部分置于 4%
          lar endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）多克隆  多聚甲醛中固定，用于病理染色；一部分在冰上分离提
          抗体（批号AF6281）购自美国Affinity公司。                        取Co6/7/8椎间盘组织，并置于－80 ℃低温冰箱中保存，
          1.3 动物与细胞                                          用于相关指标检测（每组随机选择6只大鼠，进行各指标
              本研究所用动物为健康清洁级雄性 SD 大鼠，共 74                     检测）。
          只（68 只大鼠的体重为 220～250 g，用于动物实验及含                    2.2.3 椎间盘组织中炎症因子水平检测
          药血清制备；6只大鼠的体重为140～160 g，用于髓核细                          称取“2.2.2”项下冻存的椎间盘组织 100 mg，加入
          胞原代提取），所有大鼠均购于北京维通利华实验动物                           100 μL 磷酸盐缓冲液（PBS），置于冷冻研磨仪中研磨
          技术有限公司，动物生产许可证号为 SCXK（京）2021-                      后，离心，吸取上清液。按 ELISA 试剂盒说明书操作步
          0011。饲养条件：规律进食，自由饮水，室温（25±2） ℃，                    骤检测上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。
          相对湿度 40%～70%，光暗周期（12 h/12 h）。所有动物                  2.2.4 椎间盘组织病理变化观察
          实验均获得苏州市中医医院医学伦理委员会批准同意                                取“2.2.2”项下 4% 多聚甲醛固定后的椎间盘组织，
         （批号为2021伦动批051）。                                    常规进行脱钙、梯度脱水、石蜡包埋后，制成5 μm切片。
              人脐静脉内皮细胞（HUVEC；产品编号：DFSC-EC-                   取部分切片行常规 HE 染色，显微镜下观察椎间盘组织
          01）购于上海中乔新舟生物科技有限公司。                               病理改变情况并拍照。
          2 方法                                               2.2.5 椎间盘组织病理性血管生成检测
          2.1 药物制备                                               取“2.2.4”项下各组大鼠部分椎间盘组织切片，梯度
              枳壳甘草汤由枳壳 10 g、当归 10 g、丹参 10 g、三棱               复水后，进行抗原修复、5% 脱脂奶粉室温孵育封闭；加
          10 g、莪术10 g、黑丑6 g、白丑6 g和甘草6 g组成。全方                 入血管生成标志物CD31一抗（稀释比例1∶200），室温孵
          加入500 mL冷水浸泡30 min，煮沸后文火煎至200 mL；                  育 2 h；加入 Alexa Fluor594 标记的羊抗兔二抗（稀释比
          药渣加入300 mL水，再次煎至200 mL；将2次药液混合                     例 1∶1 000），室温孵育 2 h；常规 DAPI 复染、封片，荧光
          后，用旋转蒸发仪将其浓缩成质量浓度为 1 g/mL（以生                       显微镜下观察并拍照，阳性表达呈红色荧光。使用
                              [7]
          药量计，下同）的药液 。精确称取 3 mg YC-1，加入                      Image J软件统计阳性表达面积比（阳性表达面积比＝阳
          197.14 μL二甲基亚砜配制成浓度为50 mmol/L的YC-1                 性表达面积/总面积×100%）。
          溶液。                                                2.2.6 椎间盘组织中血管生成相关蛋白表达检测
          2.2 动物实验                                               采用 Western blot 法检测。称取“2.2.2”项下冻存的
          2.2.1 动物造模、分组与给药                                   椎间盘组织 100 mg，加入 200 μL RIPA 裂解液，置于冷
              将48只大鼠随机分为假手术组（8只）和造模组（40                      冻研磨仪中研磨后，以12 000 r/min离心20 min，吸取上
          只）。造模组大鼠参考文献[8]方法构建 IDD 模型：大鼠                      清液，采用 BCA 法测定总蛋白浓度，加入 loading buffer
          以3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）腹腔注射麻醉后，用乙醇对                      后加热使蛋白变性。取变性蛋白上样后，以十二烷基硫
          尾部 Co6/7/8 节段进行消毒，用 29G 针头避开动静脉穿                   酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压 150 V，电泳时间 50
          刺尾椎间盘，向椎间盘中心穿刺5 mm，刺入后针头旋转                         min）分离，将印迹转移（电流400 mA，转膜时间35 min）
          360°并留置 10 s，消毒并标记穿刺位置，并以输液贴保                      至 PVDF 膜，以 5% 脱脂奶粉封闭 1 h；加入 GAPDH、
          护。假手术组大鼠采用 21G 针头在相同节段穿刺皮肤                         HIF-1α、VEGF、VEGFR2、Ang 1、Ang 2 一抗（稀释比例
          和肌肉（深度约为 2 mm），不损伤椎间盘。造模后大鼠                        分别为 1∶5 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000、
          自由活动，1周后，若大鼠尾椎X线检查显示椎间盘高度                          1∶1 000），在4 ℃下孵育过夜；次日洗膜后加入对应HRP
                             [9]
          下降，则证明造模成功 。将造模成功的40只大鼠随机                          标记的羊抗兔二抗（稀释比例1∶10 000），在室温下孵育
          分为模型组、HIF-1α抑制剂组和枳壳甘草汤低、中、高剂                       1 h。利用化学发光成像系统进行显影，使用 Image J 软
          量组，每组8只。HIF-1α抑制剂组大鼠尾静脉注射YC-1                      件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参（GAPDH）
                          [10]
          溶液[2 mg/（kg·d）] ；枳壳甘草汤低、中、高剂量组大鼠                   蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

          中国药房  2025年第36卷第7期                                                 China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 7    · 809 ·
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