Page 48 - 《中国药房》2025年7期
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2.3 细胞实验                                            吸光度，并计算细胞增殖率。细胞增殖率（%）＝（实验
          2.3.1 枳壳甘草汤含药血清制备                                   组吸光度－空白孔吸光度）/（空白对照组吸光度－空白
              取 SD 大鼠 20 只，随机分为空白对照血清组和枳壳                     孔吸光度）×100%。
          甘草汤含药血清组，各10只。枳壳甘草汤含药血清组按                           2.3.6 共培养后HUVEC迁移能力检测
          临床等效剂量灌胃6.12 g/（kg·d）枳壳甘草汤，空白对照                         按“2.3.3”项下分组操作，每组设置 6 个复孔。完成
          血清组大鼠灌胃等体积生理盐水，每天 1 次，连续 7 d。                       共培养后取出 Transwell 小室，用 PBS 冲洗 3 次后用 4%
          末次灌胃 1 h 后，以 3% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，                      多聚甲醛固定 20 min；PBS 冲洗 2 次，用 0.1% 结晶紫染
          腹主动脉采血，离心分离血清，56 ℃恒温水浴灭活 30                         液染色 20 min，再次用 PBS 冲洗掉多余的染料；用棉签
          min，微孔滤膜过滤除菌，分别得到空白对照血清和含药                          轻轻擦拭掉上室膜上未穿透的细胞，将小室膜取下，放
          血清，－80 ℃保存备用。                                       在载玻片上，用中性树胶封片。在显微镜下观察并计数
          2.3.2 大鼠原代髓核细胞提取与培养                                 下室膜上的细胞数量，每组随机选取6个视野进行计数。
              取 6 只 SD 大鼠（体重 140～160 g），以 3% 戊巴比妥             2.3.7 共培养后HUVEC成管能力检测
          钠腹腔注射麻醉后脱颈处死，乙醇浸泡消毒 2 min。切                             将 DMEM/F12 培养基和预冷的 Matrigel 基质胶按
          下尾部后剥离尾部皮肤，浸泡于乙醇中，转移至超净台。                           体积比2∶1混合后配制实验用胶，并按300 μL/孔加入24
          在超净台中切开大鼠椎间盘，以刮匙取出髓核，剪成大                            孔板中，置于培养箱中固化。按“2.3.3”项下分组操作，
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          小约 1 mm 的碎块，用 0.2% 的Ⅱ型胶原酶 37 ℃消化 2                  每组设置 6 个复孔，完成共培养后收集 HUVEC。采用
          h，细胞筛网过滤组织残渣，离心后弃上清。用含10%胎                          无血清培养基进行重悬，向铺好基质胶的24孔板中加入
                                                                            4
          牛血清和 1% 双抗的 DMEM/F12 细胞培养基重悬细胞，                     细胞悬液（2×10 个/孔），37 ℃培养箱中培养 4 h 后，观
          然后置于培养箱中常规培养。                                       察血管形成情况，并拍照。采用 Image J 软件分析成管
          2.3.3 髓核细胞分组干预后与HUVEC共培养                            情况，统计血管分支数量、总长度、总分支长度。
              将第 2 代髓核细胞按 5×10 个/孔接种于 6 孔板中，                  2.3.8 共培养后HUVEC中HIF-1α、VEGF、Ang 2 mRNA
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          随机分成空白对照组、TNF-α 组、YC-1 组和 5%、10%、                   的表达检测
          15%含药血清组。除空白对照组外，其余各组均采用50                              按“2.3.3”项下分组操作，每组设置 6 个复孔。完成
                                          [11]
          ng/mL TNF-α诱导髓核细胞退变模型 ；同时，空白对照                      共培养后收集 HUVEC，提取细胞中总 RNA，测定 RNA
          组、TNF-α 组加入10%空白对照血清；YC-1组加入10%                     浓度及纯度。合成cDNA后进行扩增实验，PCR反应体
          空白对照血清+0.2 mmol /L YC-1；5%、10%、15%含药血               系（20 μL）为：PCR 试剂 10 μL，正、反向引物各 0.4 μL，
                                             [7]
          清组分别加入 5%、10%、15% 含药血清 ）。干预 24 h                    cDNA 模板 2 μL，dd H2O 7.2 μL。扩增条件为：95 ℃预
          后，与提前接种于 Transwell 小室上室中的 HUVEC（2×                  变性 30 s；95 ℃变性 10 s，60 ℃延伸/退火 30 s，循环 40
          10 个/孔）在37 ℃培养箱中共培养24 h。                            次。以 GAPDH 为内参，采用 2         －ΔΔCt 法计算细胞中 HIF-
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          2.3.4 共培养后髓核细胞中 Collagen Ⅱ和 MMP-3 蛋白                1α、VEGF、Ang 2 mRNA表达情况。引物委托生工生物
          表达检测                                                工程（上海）股份有限公司设计并合成，引物序列及扩增
              按“2.3.3”项下分组操作，每组设置 6 个复孔。完成                    产物大小见表1。
          共培养后的髓核细胞加入 4% 多聚甲醛固定 20 min，加                                表1 引物序列及扩增产物大小
          入50 μL 1%破膜剂破膜20 min，再加入5%牛血清白蛋                     基因          引物序列（5′→3′）              扩增产物大小/bp
                                                              HIF-1α      正向：CTAACTAGCCGAGGAAGAACTATGAAC  107
          白室温孵育 30 min；加入 Collagen Ⅱ和 MMP-3 一抗（稀
                                                                          反向：CACTGAGGTTGGTTACTGTTGGTATC
          释比例均为 1∶200），4 ℃孵育过夜；次日加入 Alexa                     VEGF        正向：GGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAG  114
          Fluor488 标记的羊抗兔二抗和 Alexa Fluor594 标记的羊                          反向：GCGGCTGGAGCACTGTCTG
                                                              Ang 2       正向：TCGGAAGAGCATGGACAGCATAG  107
          抗兔二抗（稀释比例均为1∶1 000），室温孵育30 min；滴
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          加含DAPI的抗荧光淬灭封片剂，置于荧光显微镜下拍照。                         GAPDH       正向：GGAGTCCACTGGCGTCTTCAC    157
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          使用Image J软件计算蛋白阳性表达面积比，Collagen Ⅱ
          蛋白阳性表达呈绿色，MMP-3蛋白阳性表达呈红色。阳                          2.3.9 共培养后 HUVEC 中 HIF-1α/VEGF/Ang 信号轴
          性表达面积比＝阳性表达面积/总面积×100%。                             及血管生成相关蛋白表达检测
          2.3.5 共培养后HUVEC增殖活性检测                                   按“2.3.3”项下分组操作，每组设置 6 个复孔。完成
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              将HUVEC均匀接种于96孔板中（5×10 个/孔），每                    共培养后收集 HUVEC，采用 Western blot 法检测细胞中
          组设置6个复孔，并设置空白孔。常规培养24 h后，加入                         相关蛋白表达情况，具体方法同“2.2.6”项下。其中，
          按“2.3.3”项下分组干预后的髓核细胞上清液继续培养                         MMP-2、MMP-9 一抗的稀释比例均为 1∶1 000，对应
          24 h，采用CCK-8法经酶标仪在450 nm波长处检测各孔                     HRP标记的羊抗兔二抗的稀释比例为1∶10 000。


          · 810 ·    China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 7                               中国药房  2025年第36卷第7期
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