Page 51 - 《中国药房》2025年4期
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2 方法                                               橼酸铅双重染色，使用透射电子显微镜观察其结肠组织
          2.1 造模、分组与给药                                       中肠上皮细胞间紧密连接情况并采集图像。
              所有小鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组，模型                        2.6 小鼠结肠组织中AMPK、Nrf2 mRNA表达的检测
          组，抑制剂组（Compound C 20 mg/kg，剂量参考相关文                     采用实时荧光定量PCR法检测。随机选取“2.2”项
            [6]
          献 设置），芍药苷低、中、高剂量组（芍药苷 12.5、25、50                   下各组小鼠冻存的结肠组织适量，以 TRIzol 法提取总
          mg/kg，剂量根据预实验结果设置）和芍药苷高+抑制剂                        RNA，经浓度、纯度检测后，逆转录合成cDNA。以上述
          组（芍药苷50 mg/kg+Compound C 20 mg/kg），每组8只。           cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系共20 μL，包括
          除对照组外，其余各组小鼠均自由饮用4%DSS溶液5 d                        cDNA 模板 2 μL、正/反向引物各 1 μL、2×Talent qPCR
                       [7]
          以构建UC模型 。随后，芍药苷各剂量组小鼠灌胃相应                          PreMix 10 μL、10 mmol/L dNTP Mixture 1 μL、Oligo-dT
          剂量的芍药苷（以水为溶剂，灌胃体积为 0.2 mL），并腹                      0.5 μL、核糖核酸酶抑制剂 0.5 μL、AMV 逆转录酶 0.5
          腔注射生理盐水 0.2 mL；抑制剂组小鼠腹腔注射 Com‐                     μL、无核糖核酸酶水 3.5 μL。反应条件为 95 ℃预变性
          pound C药液（以生理盐水为溶剂，注射体积为0.2 mL），
                                                             15 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 31 s，72 ℃延伸 31 s，
          并灌胃水 0.2 mL；对照组和模型组小鼠灌胃水 0.2 mL，
                                                             共 40 个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内
          并腹腔注射生理盐水0.2 mL；每天1次，连续7 d。
                                                             参，按照 2   －ΔΔCt 法计算 AMPK、Nrf2 mRNA 的相对表达
          2.2 小鼠体重记录、结肠长度测量及标本收集
                                                             量，结果以对照组为参照进行归一化处理。本研究所用
              实验期间，每天称定并记录各组小鼠的体重。末次
                                                             正/反向引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计、
          给药 24 h 后，以吸入 CO2麻醉后将小鼠处死，分离其结
                                                             合成，具体信息见表2。
          肠，拍照并测量长度；以生理盐水漂洗结肠后，随机选取
                                                                         表2 引物序列和产物大小
          各组6只小鼠相同部位的结肠组织，裁剪到合适大小，于
                                                              基因           引物序列（5′→3′）               产物大小/bp
          2 min 内放入 2.5% 戊二醛溶液中固定，用于透射电镜观                     AMPK         正向：AGCCAAATCAGGGACTGCTA    136
          察。另取上述小鼠相同部位、相同长短的结肠组织，置                                         反向：GAGGGAGGTGACAGATGAGG
          于4%多聚甲醛溶液中固定，用于组织病理学分析；取剩                           Nrf2         正向：GACTACAGTCCCAGCAGAGTG   100
                                                                           反向：TCTGCGTGCTCAGAAACCTC
          余结肠组织，剪开清洗内容物后，于－80 ℃下冻存，用于
                                                              GAPDH        正向：TGACCTCAACTACATGGTCTACA  85
          相关指标检测。                                                          反向：CTTCCCATTCTCGGCCTTG
          2.3 小鼠结肠组织中氧化应激指标检测
                                                             2.7 小鼠结肠组织中 AMPK、Nrf2、HO-1、occludin、
              随机选取“2.2”项下各组小鼠冻存的结肠组织适量，
                                                             claudin-1蛋白表达的检测
          加生理盐水，匀浆，再于 4 ℃下以 3 000 r/min 离心 10
                                                                 随机选取“2.2”项下各组小鼠冻存的结肠组织适量，
          min，取上清液。按照试剂盒说明书方法，使用酶标仪检
                                                             剪碎后置于 1.5 mL 离心管中，加入组织裂解液，充分匀
          测其中MDA含量及SOD、GSH-Px活性。
                                                             浆，以 12 000 r/min 离心 10 min，取上清液，采用 BCA 法
          2.4 小鼠结肠组织病理学形态观察
                                                             进行蛋白定量，并于 95 ℃加热 10 min 使变性。取变性
              随机选取“2.2”项下各组小鼠固定于 4% 多聚甲醛
                                                             蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离
          溶液中的结肠组织适量，经乙醇梯度脱水、常规石蜡包
                                                             并转移至硝酸纤维素膜上，以封闭液封闭 15 min；以
          埋后切片（厚约 4 μm）。取切片，进行 HE 染色，使用显
                                                             PBST 缓冲液洗膜后，加入 β-actin、AMPK、p-AMPK、
          微镜观察其病理改变并进行组织病理学评分（组织病理
                                                             Nrf2、HO-1、occludin、claudin-1 一抗（稀释比例分别为
          学评分＝黏膜水肿评分+炎症细胞浸润评分+上皮完整
                                                             1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶8 000、1∶2 000、1∶2 000、
          性评分+上皮增生比例评分），具体标准 见表1。
                                           [7]
                                                             1∶2 000），于4 ℃孵育过夜；以PBST缓冲液洗膜后，加入
                      表1 组织病理学评分标准
                                                             相应二抗（稀释比例均为1∶1 000），于室温孵育1 h；用高
          评分    黏膜水肿     炎症细胞浸润      上皮完整性      上皮增生比例
          0     无变化       无变化         无变化         无变化        灵敏度ECL化学发光试剂显影，于化学发光凝胶成像系
          1      轻度        轻度       上皮细胞轻微脱落     1%～50%      统上成像。使用 Image J 软件分析条带灰度值，以目的
          2      中度        中度       上皮细胞严重脱落    ＞50%～＜100%
          3      重度        重度         上皮溃疡        100%       蛋白与内参蛋白 β-actin 的条带灰度值比值表示目的蛋
          4                        上皮溃疡并破坏隐窝                 白的相对表达量，以p-AMPK与AMPK蛋白的灰度值比
          2.5 小鼠结肠组织中肠上皮细胞间紧密连接情况观察                          值作为AMPK蛋白的磷酸化水平。
              取“2.2”项下各组小鼠固定于2.5%戊二醛溶液中的                     2.8 统计学方法
          结肠组织适量，以0.1 mmol/L磷酸盐缓冲液漂洗3次，用                         使用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。数据以
          1% 锇酸固定液固定 2 h，再经梯度乙醇和丙酮脱水、渗                       x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两
          透、包埋后切片（厚 60～80 nm）。取切片，进行醋酸-枸                     两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。


          中国药房  2025年第36卷第4期                                                 China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 4    · 429 ·
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