Page 31 - 《中国药房》2025年4期
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物研究所提供，动物生产许可证号为 SCXK（黔）2021-                      2.5 大鼠血清中肝功能指标及HYP水平测定
          0003。所有动物饲养于贵州中医药大学动物研究所，实                             取“2.2”项下各组大鼠血清适量，常规解冻后，按照
          验期间大鼠自由进食与饮水。本研究严格遵循“3R”原                          试剂盒说明书操作，使用全自动生化分析仪检测大鼠血
          则，动物处理严格按照《实验动物管理条例》进行。                            清中ALT、AST、HYP水平。
          2 方法                                               2.6 大鼠肝组织病理观察
          2.1 分组、造模与给药                                           取“2.2”项下于 4% 多聚甲醛溶液中固定 24 h 的大
              大鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法将38只大                        鼠肝组织，制备石蜡切片（厚度 3 μm），行 HE 和 Masson

          鼠分为对照组（n＝7），模型组（n＝7），地锦草低、中、高                      染色后，封片，采用荧光显微镜于白光下观察大鼠的肝
          剂量组（n＝6）和水飞蓟宾组（阳性对照，n＝6）。除对照                       组织病理变化。应用 Image Pro Plus 6.0 软件对 Masson
          组外，其余各组大鼠均腹腔注射 3 mL/kg 的四氯化碳                       染色照片进行阳性染色（呈蓝色）面积测算，并计算阳性
         （CCl4 ）和橄榄油（2∶3，V/V）溶液以制备HF模型，每周注                   染色百分比[阳性染色百分比（%）＝阳性染色面积/总面
                                                  [10]
          射2次（每周一、四上午分别注射1次），连续8周 ；对照                        积×100%]，以此为指标评价HF程度。
          组大鼠腹腔注射等体积生理盐水和橄榄油（2∶3，V/V）溶                       2.7 大鼠肝组织中TGF-β1、α-SMA表达测定
          液。造模结束后，随机处死对照组和模型组大鼠各1只，                              采用免疫组化法测定。取“2.2”项下冻存的大鼠肝
          通过苏木精-伊红（HE）和 Masson 染色观察大鼠的肝组                     组织（每组选4只大鼠的肝组织），经组织脱水、透明、浸
          织病理变化。根据 Metavir 分期评分系统——HF 分期
                                                             蜡、包埋、切片与烤片、脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧
          评分标准，以HF分期≥2期表示HF模型制备成功 。
                                                    [11]
                                                             化物酶、血清封闭等常规操作后，加入 TGF-β1、α-SMA
              根据 2020 年版《中国药典》（一版）中地锦草推荐剂
                                                             一抗（稀释比例分别为 1∶100、1∶200），于 4 ℃湿盒孵育
          量与国医大师周仲瑛教授在治疗HF及肝硬化中地锦草
                                                             15 h。冲洗后，加相应二抗，于37 ℃孵育30 min，再次冲
                    [6]
          的使用剂量 ，确定该药的成人剂量为 0.214 g/kg，再通
                                                             洗后，加入 DBA 显色液，常规进行复染、脱水、封片，最
          过体表面积法换算得到大鼠的临床等效剂量为 1.35
                                                             后采用生物显微镜拍照。采用 Image Pro Plus 6.0 软件
          g/kg，故地锦草低、中、高剂量组大鼠分别给予0.5、1、2倍
                                                             对免疫组化照片进行阳性光密度分析（阳性染色呈棕黄
          临床等效剂量地锦草，即0.675、1.35、2.70 g/kg。水飞蓟
                                                             色），以阳性光密度值大小来反映蛋白的表达水平。
          宾的成人剂量为 3 mg/kg，根据体表面积法换算后得到
                                                             2.8 大鼠肝组织中 TNF-α、NF-κB p65 mRNA 表达
          大鼠的临床等效剂量为 18.9 mg/kg。造模成功后，各给
                                                             检测
          药组大鼠灌胃相应药物，对照组和模型组大鼠灌胃等体
                                                                 采用 qRT-PCR 法检测。取“2.2”项下冻存的大鼠肝
          积生理盐水，灌胃体积均为 10 mL/kg，每天 1 次，连续
                                                             组织（每只大鼠约100 mg），采用Trizol法提取肝组织中
          30 d。
                                                             总 RNA，测定总 RNA 浓度后，将其逆转录成 cDNA，并
          2.2 动物取材与处理
                                                             以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应程序如下：
              末次给药后，各组大鼠禁食不禁水12 h，称重，然后
                                                             95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 60 s，
          腹腔注射盐酸替来他明盐酸唑拉西泮（50 mg/kg）麻醉大
                                                             95 ℃延伸 15 s，循环 40 次。扩增体系如下（20 μL）：
          鼠，再于腹主动脉取血，室温静置2 h后，离心得血清，置
                                                             cDNA 模板 4 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，上、下
          于－80 ℃暂存。取血结束后，用颈椎脱臼法处死大鼠，
          取完整肝脏，称重；另取大鼠新鲜的肝右叶组织，一部分                          游 引 物 各 0.4  μL，50×ROX  Reference  Dye  2  0.4  μL，
          用4%多聚甲醛溶液固定，另一部分置于－80 ℃冰箱中                         H2O 4.8 μL。以 GAPDH 为内参，采用 2       －ΔΔCt 法计算肝组
          保存，备用。                                             织中 TNF-α、NF-κB p65 mRNA 的相对表达量。引物由
          2.3 大鼠肝指数计算                                        北京擎科生物科技股份有限公司设计并合成，引物序列
              根据大鼠取材前体重和取材后肝脏湿重计算肝指                          及产物长度见表1。
          数：肝指数（%）＝取材后肝脏湿重（g）/大鼠取材前体重                                    表1 引物序列及产物长度
                                                              基因           引物序列（5′→3′）               产物长度/bp
         （g）×100%。
                                                              GAPDH        上游：ACAGCAACAGGGTGGTGGAC    252
          2.4 大鼠血清中炎症因子指标水平测定                                              下游：TTTGAGGGTGCAGCGAACTT
              取“2.2”项下各组大鼠血清适量，常规解冻后，按照                       TNF-α        上游：CCGATTTGCCATTTCATACCAG  232
                                                                           下游：TCACAGAGCAATGACTCCAAAG
          ELISA试剂盒说明书操作，使用酶标仪检测大鼠血清中
                                                              NF-κB p65    上游：ACCTGTTCCAAAGAGCACCC    113
          TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-6水平。                                        下游：GGTCTGTGTTGTTGCCAAGC


          中国药房  2025年第36卷第4期                                                 China Pharmacy  2025 Vol. 36  No. 4    · 409 ·
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